下丘脑Sonic hedgehog阳性细胞谱系追踪分析

摘要

目的：SBE2（Shh brain enhancer-2，SBE2）作为Shh在下丘脑区域的特异性增强子，其表达与内源性Shh的表达状况相比，SBE2阳性细胞可以特异代表下丘脑Shh表达细胞的分布，通过追踪SBE2阳性细胞，进而可以追踪下丘脑中Sonic hedgehog（Shh）阳性细胞的表达位置及其子代细胞的发育去向。同时构建了SBE2-Cre转基因小鼠，检验其是否可以作为研究基因在下丘脑区域功能的重要工具鼠。
　　方法：在研究中构建了SBE2-Cre转基因小鼠，通过Rosa26-mTmG报告基因小鼠和SBE2-Cre转基因小鼠交配，获得E10.5，E12.5，E16.5期的小鼠胚胎及P10期的小鼠，通过基因分型，获得 Rosa26-mTmG/SBE2-Cre双阳性小鼠胚胎，将胚胎脑部经过PFA固定，蔗糖沉降，OCT包埋等一系列步骤，切片处理，荧光显微镜下拍照观察，比较各时期 SBE2阳性表达区域位置的变化状况。之后将Rosa26-LacZ报告基因小鼠与SBE2-Cre转基因小鼠交配，获得E10.5，E12.5期Rosa26-LacZ/SBE2-Cre双阳性胚胎。通过对各时期胚胎进行 LacZ染色，比较SBE2阳性细胞在脑部的分布。为了证明以上结果使用探针提取，胚胎整体原位杂交，切片原位杂交等方法，获得小鼠胚胎脑中 Shh阳性细胞的表达位置，进一步证明，对SBE2+细胞进行追踪的结果。
　　结果：SBE2是一段高度保守的序列，作为Shh特异性增强子能够驱动Shh在下丘脑的表达，在调节下丘脑 Shh的表达过程中起着关键的作用。研究中构建了SBE2-Cre小鼠，结合 Rosa26-mTmG报告基因小鼠和Rosa26-LacZ报告基因小鼠对 Shh阳性细胞进行了细胞谱系追踪研究。揭示了从小鼠胚胎期到小鼠出生后下丘脑中SBE2阳性细胞的时空表达模式：SBE2在小鼠胚胎脑的视囊（POA）开始表达，沿下丘脑前侧到下丘脑后侧，整个表达区域包含了下丘脑内各种神经核，在腹侧下丘脑有着较强的表达。而且SBE2在下丘脑的表达是一个动态的过程，随位置的变化表达强度也随之发生变化。在小鼠胚胎期到出生后的整个发育阶段，SBE2在各时期的表达略有差别，但总体来说是一个动态且延续的过程。通过 SBE2谱系追踪的结论，对比原位杂交后 E10.5，E12.5期小鼠胚胎脑部Shh的表达分布，对SBE2示踪的结果给予了有力的支持。
　　结论：SBE2+细胞特异性的代表下丘脑Shh阳性细胞的分布，是作为分化形成下丘脑神经核的主要细胞的来源之一，通过一系列的实验揭示了下丘脑 Sonichedgehog（Shh）阳性细胞及其子代细胞的发育去向。经过对之前的研究讨论可知在下丘脑Shh的表达受多种转录因子共同调控，SBE2同时在各方面对Shh进行调节。且SBE2-Cre小鼠可作为研究基因在下丘脑区域功能的重要工具鼠，这神经发育的研究过程中起到重要作用。

目录

声明

符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

研究对象和方法

1.1研究对象

1.2方法

结果

2.1 mTmG追踪

2.2 Shh探针提取

2.3 SBE2-Cre与Rosa26-mTmG杂交E10.5期胚胎的表达

2.4 SBE2-Cre与Rosa26-mTmG小鼠杂交E12.5期胚胎的的表达

2.5 SBE2-Cre与Rosa26-mTmG报告基因小鼠杂交E16.5期胚胎的表达

2.6 SBE2-Cre与Rosa26-mTmG小鼠杂交P10期小鼠的表达

2.7 SBE2-Cre小鼠可作为研究下丘脑功能的工具鼠

讨论

小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:Sonic hedgehog信号在小鼠下丘脑发育中的作用

致谢

个人简历