激动性CD40单链抗体增强小鼠NK细胞抗肿瘤作用

摘要

目的：
　　构建激动性抗小鼠CD40单链抗体的原核表达载体，诱导蛋白表达并纯化以获得高纯度的激动性抗小鼠CD40 scFv。建立小鼠肿瘤模型并体内外验证激动性抗小鼠CD40scFv增强自然杀伤（NK）细胞杀伤肿瘤的作用。
　　方法：
　　本实验利用基因工程技术构建激动性抗小鼠CD40 scFv原核表达载体，诱导蛋白表达后利用亲和层析技术获得高纯度的激动性抗小鼠CD40 scFv蛋白。在体外实验中使用小鼠骨髓干细胞诱导产生树突状细胞（DC），给予激动性抗小鼠CD40 scFv激活DC细胞，流式细胞术检测DC细胞表面CD80、CD86、MHC-II表达水平，ELISA检测培养上清中IL-12表达水平，以反应CD40scFv对DC的激活能力。利用CD40 scFv激活后的DC及培养上清刺激通过免疫磁珠分选出的小鼠NK细胞，ELISA检测NK细胞培养上清中IFN-γ水平。将激活后的NK细胞与T6-17细胞共培养，用WST-8法检测激活后NK细胞对T6-17杀伤性的变化。在体内实验中，构建Balb/c nude鼠的T6-17肿瘤模型，给予激动性抗小鼠CD40 scFv瘤体注射，记录并对比肿瘤生长数据。处死小鼠后以ELISA法检测肿瘤微环境中IL-12和IFN-γ水平，抽提肿瘤浸润淋巴细胞并以流式细胞术检测其中NK细胞数量的变化，瘤体组织切片以免疫组化法检测NKG2D表达水平的变化。
　　结果：
　　成功构建CD40scFv-pET28a重组质粒，并经基因测序验证无误。SDS-PAGE电泳和His-tag Western blot检测证实CD40 scFv表达成功，蛋白大小约27kDa；纯化后所获得条带单一，BCA蛋白定量测得纯化蛋白样品浓度为1.122mg/ml。体外成功诱导分化小鼠DC细胞；CD40 scFv激活后的DC细胞MHC-II、CD80、CD86的表达水平分别为90.49%±3.77%、87.99%±3.35%和94.07%±3.13%，较阴性对照组明显上调（P=0.000，P=0.000，P=0.010）。CD40 scFv组DC细胞的培养上清中IL-12水平为555.86±40.48 pg/ml，较阴性对照组明显升高（P=0.000）。利用各组激活后的DC细胞及培养上清刺激NK细胞后，NK细胞培养上清IFN-γ水平为296.71±24.62 pg/ml，较阴性对照组明显升高（P=0.015）。CD40 scFv组NK细胞的对T6-17细胞杀伤能力为72.23%±3.99%，也较阴性对照组明显升高(P=0.004)。体内实验中成功构建Balb/c nude鼠的T6-17肿瘤模型，激动性抗小鼠CD40 scFv对Balb/c nude鼠的T6-17肿瘤模型生长有抑制作用，肿瘤最终生长体积相较于阴性对照组显著降低（P=0.000）。CD40 scFv组肿瘤微环境中IL-12和IFN-γ水平分别为188.801±32.718 pg/ml和121.428±30.994 pg/ml，均较NS组显著升高（分别为P=0.023和P=0.006）。CD40 scFv组TIL中CD3-DX5+细胞比例可达19.15%±2.24%，较NS组明显升高（P=0.002）。CD40 scFv组肿瘤组织NKG2D蛋白表达阳性率为8.18%±2.01%，其表达水平较 NS组显著升高（P=0.005）。
　　结论：
　　①成功构建激动性抗小鼠CD40scFv的原核表达载体，并纯化获得高纯度的激动性抗小鼠CD40 scFv。
　　②激动性抗小鼠CD40 scFv在体外加强小鼠DC细胞激活水平，上调其MHC-II、CD80、CD86的表达水平并加强其IL-12的分泌；被CD40 scFv激活的DC细胞可以加强NK细胞的激活水平，增加其IFN-γ的分泌并加强其杀伤能力。
　　③激动性抗小鼠CD40 scFv在体内可以抑制Balb/c nude鼠T6-17肿瘤的生长，增加肿瘤微环境中IL-12、IFN-γ水平，巢集NK细胞到肿瘤微环境中并上调其激动性受体NKG2D的表达水平。

目录

声明

缩略语/符号说明

前言

研究背景

研究目的、方法

1对象与方法

1.1实验技术路线图

1.2实验动物及细胞系

1.3主要试剂

1.4主要溶液及培养基配方

1.5主要仪器

1.6实验方法

1.7 统计学方法

2.实验结果

2.1.1 PCR引入酶切位点并扩增CD40 scFv基因片段的结果

2.1.2 T4-DNA连接反应电泳结果

2.1.3 CD40scFv-pET28a重组质粒基因测序结果

2.1.4 目的蛋白的表达与纯化结果

2.1.5 目的蛋白His-tag的Western Blot鉴定

2.1.6 BCA蛋白定量的结果

2.2.1 DC细胞体外诱生培养的结果

2.2.2 T6-17肿瘤细胞系的传代培养

2.2.3 激活后DC表面CD80、CD86及MHC-II的水平变化

2.2.4 1DC细胞培养上清的IL-12水平

2.2.51NK细胞磁珠阴性分选的鉴定

2.2.71NK细胞杀伤能力的检测

2.3.1 Balb/c nude鼠 T6-17细胞肿瘤模型

2.3.2 肿瘤生长情况

2.3.3 TIL中CD3-DX5+细胞的水平

2.3.4 肿瘤微环境中IL-12及IFN-γ水平

2.3.5肿瘤组织中NKG2D表达水平的变化

3.讨论

3.1 CD40分子与激动性CD40抗体

3.2 激动性CD40单链抗体

3.3 激动性CD40抗体的免疫调节作用

4.展望

结论

参考文献

发表论文和参加科研说明

综述:NK细胞功能与NK细胞表面调节性受体

致谢

个人简历