携带抗CD40单链抗体的突状细胞的肿瘤免疫治疗作用及CD4+T细胞表面CD40的表达及作用研究

摘要

携带抗CD40单链抗体的树突状细胞的肿瘤免疫治疗作用。
　　 目的:
　　 抗CD40激活型抗体和IL-2的共同作用可以有效地促进免疫系统的抗肿瘤作用。这一治疗虽然能够有效地促进初次免疫应答，但它减弱了再次免疫应答。研究表明CD4+T细胞的凋亡可能是影响CD8+T细胞的记忆反应的原因。抗CD40激活型抗体的作用靶点是表达CD40的细胞，主要是具有抗原递呈作用的树突状细胞(DC)或巨噬细胞(M(p))。激活的M(p)所分泌的IFN-Υ可能是引起CD4+T细胞凋亡的重要原因。本课题将首先证明抗CD40激活型抗体作用于DC和M(p)所产生的IFN-Υ的不同及其对CD4+T细胞增殖和凋亡的不同影响。为了降低激活的M(p)对CD8+T细胞记忆反应的影响，将克隆抗CD40激活型抗体的单链抗体(scFv)，并采用慢病毒感染的方法制备携带CD40 scFv的DC。通过体内和体外实验，研究携带抗CD40 scFv的DC的抗肿瘤作用。
　　 方法:
　　 (1)CD4+T细胞和DC或M(p)共培养，用流式细胞术检测CD4+T细胞的增殖和凋亡情况，以确定DC和M(p)激活后对CD4+T细胞的不同影响及DC和M(p)激活后分泌IFN-Υ的情况。
　　 (2)采用RT-PCR和重叠延伸PCR获得抗CD40激活型抗体的scFv基因，构建含有重组大鼠抗小鼠的抗CD40激活型抗体的单链抗体的慢病毒穿梭质粒，并与其它包装质粒一起通过磷酸钙感染293T细胞，得到假病毒，用于感染DC。
　　 (3)从不同角度流式分析感染Venus空载体和携带抗CD40单链抗体的YFP阳性DC的激活程度，以确定携带抗CD40单链抗体的DC能被有效地激活。
　　 (4)通过体内实验检测携带抗CD40单链抗体的DC对肿瘤的免疫治疗作用。小鼠皮下注射EG7细胞，将荷瘤小鼠分成5组，分别是PBS组，DC感染Venus空载体组，DC感染Venus-CD40-scFv组，DC感染Venus空载体并用OVA孵育过夜组，DC感染了Venus-CD40-scFv并用OVA孵育过夜组，通过测量肿瘤的生长情况评价携带抗CD40单链抗体的DC对肿瘤的免疫治疗效果。
　　 结果:
　　 (1)实验证明了DC和M(p)激活后对CD4+T细胞的不同影响，与M(p)比较，DC能够促进CD4+T细胞的增殖，并且分泌较少的IFN-Υ。
　　 (2)成功克隆了大鼠抗小鼠的抗CD40激活型抗体的scFv，并制备了表达此scFv的慢病毒穿梭质粒，并与其他包装质粒一起通过磷酸钙法感染293T细胞，得到有效的慢病毒。
　　 (3)对比感染Venus空载体和携带抗CD40单链抗体的DC激活情况，说明携带抗CD40单链抗体的DC能够被有效地激活。
　　 (4)体内实验初步证明携带抗CD40单链抗体的DC能够有效抑制肿瘤的生长。
　　 结论:
　　 本研究表明激活的DC能够更有效地促进CD4+T细胞的增殖，并初步证明了携带抗CD40单链抗体的DC对肿瘤的免疫治疗有促进作用。

目录

声明

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引言

第一章 携带抗CD40单链抗体的树突状细胞的肿瘤免疫治疗作用

前言

材料与方法

实验结果

讨论

参考文献

第二章 CD4+T细胞表面CD40的表达及其功能

前言

材料与方法

实验结果

讨论

参考文献

综述

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附录1 中英文缩略语对照表

附录2 主要试剂配制

致谢