共载阿霉素和miR-122的纳米体系联合治疗肝癌的研究

摘要

目的：
　　肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）在全球范围内致死率疾病中排行第三，且有逐年上升的趋势。虽然治疗手段中手术居于选择首位，但遗憾的是大多数患者就诊时已失去手术机会，因此，尤其对于中晚期患者来讲，寻找一种有效安全的治疗手段极其重要。近年来，纳米材料以其易降解、低毒性、缓释等自身优势成为药物递送载体领域的研究热点。采用纳米材料包覆化疗药物治疗肿瘤，具有显著抑瘤作用，并且可以降低化疗药物的全身毒副作用，进一步研究显示，化疗药物联合基因治疗，可有效增强药物疗效，且从基因层面调节细胞代谢，实现协同抑瘤作用。microRNA-122（简称miR-122）是肝脏特异性miRNA，在HCC中呈低表达状态，与肝脏肿瘤的发生、发展具有紧密联系。miR-122可直接或间接干预耐药相关基因及蛋白的表达，从而提高肿瘤细胞的化疗药物敏感性，与化疗药物联合应用可发挥协同抗瘤作用。本研究采用一种β-环糊精星型阳离子聚合物（sCDP），同时包载抗肿瘤药物阿霉素（Doxorubicin,DOX）和miRNA-122，制备药物/基因共载纳米粒子，然后，对纳米粒子的性质进行了表征，并且在体内外研究了其对肝癌细胞的作用及作用机制。
　　方法：
　　1）以DOX为药物模型，采用透析法制备不同投料比的sCDP/DOX纳米粒子，DLS测定粒径及电位，紫外光谱法测定其载药量（Loading content，LC）及包封率（Encapsulation Efficiency，EE），确定最适制备比例；采用透射电镜观察纳米粒子的形态，动态透析法研究药物体外释放速率。
　　2）采用凝胶电泳实验评估sCDP/DOX纳米粒子的复合miR-122的能力，动态激光粒度分析仪（DLS）测定粒径及电位；采用透射电镜（TEM）观察最适sCDP/DOX/miR-122纳米粒子的形态。
　　3）采用qRT-PCR检测sCDP/DOX/miR-122处理HepG2细胞的miR-122的表达水平；采用流式细胞术和激光共聚焦显微镜（CLSM）检测HepG2细胞摄取DOX和miR-122的情况。
　　4）采用CCK-8试剂盒测定sCDP/DOX/miR-122纳米粒子对HepG2细胞的毒性；利用Annxin-V-APC/7-AAD细胞凋亡分析试剂盒检测其对细胞凋亡的影响；采用western blot检测p53、casepase3等蛋白的表达。
　　5）利用qRT-PCR和western blot分别在mRNA水平和蛋白水平上检测miR-122靶基因Bcl-w、CCNG1、MDR1及MRP等的表达。
　　6）构建裸鼠皮下肝癌模型，考察给药后荷瘤裸鼠的肿瘤生长情况。
　　结果：
　　第一部分：
　　1）成功制备了不同投料比的sCDP/DOX载药纳米粒子；当sCDP/DOX质量比为10:3时，纳米粒子平均粒径为183.8nm，多分散系数（polydispersity index,PDI）为0.169，zeta电位为+20.3 mV，LC为12.62%，EE为48.16%，纳米粒子呈现不规则形态；sCDP/DOX纳米粒子在较低pH值介质中药物释放最多，具有pH敏感性。
　　2）当N/P≥10时，sCDP、sCDP/DOX均可高效复合miR-122；N/P为10/1制备的sCDP/DOX/miR-122纳米粒子平均粒径为160.4±2.051nm，PDI为0.177，zeta电位为20.4±0.283mV，纳米粒子形态均一，呈规则球形，稳定性良好。
　　第二部分：
　　1）sCDP/DOX/miR-122纳米粒子可被HepG2细胞成功摄取，使细胞内miR-122表达水平显著升高；sCDP/DOX/miR-122纳米粒子在细胞中的摄取量呈现时间依赖性，并能逐渐释放DOX进入细胞核。
　　2）sCDP具有良好的生物相容性；sCDP/DOX/miR-122纳米粒子可以显著抑制HepG2细胞增殖活性，促进细胞凋亡，提高p53、cleaved caspase-3表达；sCDP/DOX/miR-122纳米粒子还可下调Bcl-w、CCNG1使细胞凋亡机制不可逆，并降低耐药相关基因MDR1、MRP表达，降低耐药蛋白P-gp，提高HepG2对DOX的敏感性，实现体外协同抑瘤作用。
　　3）sCDP/DOX/miR-122纳米粒子可以减缓荷瘤裸鼠体重降低，显著抑制裸鼠肿瘤生长，实现体内协同抑瘤作用。
　　结论：
　　本研究选取β-环糊精星型阳离子聚合物作为纳米载体，实现了阿霉素与miR-122的高效共载，获得了均匀稳定的sCDP/DOX/miR-122共载纳米粒子；该纳米粒子可以成功进入细胞，使胞内miR-122的表达水平升高；体内外研究表明，sCDP/DOX/miR-122纳米粒子呈现高效抑瘤作用；细胞水平探讨抑瘤机制发现，sCDP/DOX/miR-122可通过干预凋亡通路因子的表达、诱导细胞凋亡、降低耐药蛋白表达及影响细胞周期的调控等机制发挥协同抗肝癌作用。本研究为开发药物/基因共载纳米体系用于肝癌治疗奠定了一定的理论基础，具有广泛的应用前景。

目录

声明

缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、sCDP/DOX/miR-122纳米共载体系的制备

1.1对象和方法

1.2结果

1.3讨论

1.4小结

二、sCDP/DOX/miR-122纳米粒子的体内外抗肝癌作用研究

2.1对象和方法

2.2结果

2.3讨论

2.4小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:药物与基因联合递送纳米载体在肿瘤治疗中的应用

致谢

个人简历