番石榴叶总黄酮促进糖尿病模型小鼠胰岛再生机制的实验研究

摘要

目的：近年来，糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)的患病率在世界范围内逐年攀升，尤其是其并发症严重威胁着人类的健康。DM病理变化均存在胰岛β细胞功能的受损或丧失，导致胰岛素分泌不足。目前DM的最常用治疗方法主要包括各类降糖药物治疗或胰岛素替代治疗，但这些治疗方法只能暂时降低血糖以及延缓并发症的发生，长期使用还易发生低血糖、胃肠道反应等诸多副作用，不能从根本上治疗糖尿病。近年来，胰岛或胰腺移植技术兴起，取得了显著进展，但由于其存在供体不足、排斥反应、技术不成熟等诸多瓶颈，临床难以广泛推广。而中医中药基于其副作用小、安全性高等优势，在治疗DM方面成效显著。因此，运用中医中药促进DM患者胰岛β细胞再生、维持其胰岛素分泌功能有可能从根本上治疗 DM。本文将通过研究番石榴叶总黄酮对链脲佐菌素(Streptozocin，STZ)诱导的DM模型小鼠胰腺组织中胰岛发育相关转录因子胰腺十二指肠同源盒因子-1(Pancreas-duodenumhomeobox-1， PDX-1）、神经元素3（Neurogenin3，Ngn3）、NK6转录因子相关基因座1（NK6 TranscriPtion Factor Related Locus1，Nkx6.1）、SRY相关促HMG盒9(SRY-related HMG-box9， SOX9)、配对盒4(Paired box4，PAX4)表达的影响，探讨番石榴叶总黄酮促进DM胰岛β细胞再生机制，为治疗DM提供新的思路及方法。
　　方法：将体重约19g的SPF级健康雄性BALB/c小鼠禁食（未禁水）过夜，次日测其空腹血糖水平及体重情况，然后按体重60 mg·kg-1剂量经腹腔连续注射STZ5天，2周后开始经小鼠尾静脉采血检测空腹血糖水平，以后每隔1周检测1次，待小鼠空腹血糖达到11.1mmol·L-1以后，再每隔3天检测1次，连续2次空腹血糖浓度≥11.1 mmol·L-1为DM小鼠模型成功，三次血糖平均值作为治疗前DM模型小鼠血糖，将注射后8周仍未达标（即空腹血糖浓度<11.1 mmol· L-1）小鼠丢弃。再将STZ诱导成功的DM模型小鼠随机分为模型组（10只）、番石榴叶总黄酮低剂量组（10只）、番石榴叶总黄酮高剂量组（10只）及二甲双胍组（10只），另设10只正常小鼠为对照。然后将番石榴叶总黄酮提取物溶于蒸馏水中行灌胃治疗，高、低剂量组按小鼠体重给予每天的提取物灌胃量分别为2g·kg-1、1g·kg-1，即番石榴叶总黄酮的剂量为0.396g·kg-1·d-1、0.198g·kg-1·d-1，二甲双胍灌胃量为0.0875g·kg-1·d-1，正常组和DM模型组以等体积蒸馏水灌胃。灌胃2周后测其空腹血糖水平及体重情况，苏木素伊红（HE）染色评价胰岛形态学改变，逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法、蛋白质印迹法（Western Blot）及免疫组化（IHC）检测胰腺组织内与胰岛β细胞发育相关的转录因子：PDX-1、Ngn3、Nkx6.1、SOX9、PAX4mRNA及蛋白的表达情况。
　　结果：本实验显示STZ诱导的DM模型小鼠的空腹血糖较正常组小鼠显著升高（P<0.01）,体重较正常组小鼠明显下降（P<0.05)；与STZ诱导的DM模型小鼠相比，番石榴叶总黄酮治疗组及二甲双胍组空腹血糖均明显降低（P<0.05)，体重增加（P<0.05)；HE染色显示模型组小鼠胰岛破坏严重，呈散在零星分布；番石榴叶总黄酮治疗组DM小鼠胰岛较模型组破坏减少，胰岛数量增加、体积增大，胰岛呈片状或沿胰腺导管分布。IHC染色显示，与正常组比较，DM模型组小鼠胰腺组织中PDX-1的表达量显著减少；番石榴叶总黄酮治疗组与DM模型组相比，小鼠胰腺组织中PDX-1的表达量均升高。RT-PCR及Western Blot检测显示， DM模型组小鼠胰腺组织中PDX-1、Ngn3、Nkx6.1、SOX9、PAX4mRNA及蛋白表达量较正常组显著下降（P<0.01）；而番石榴叶总黄酮治疗组与DM模型组比，胰腺组织中与胰岛再生相关的转录因子PDX-1、Ngn3、Nkx6.1、SOX9、PAX4mRNA及蛋白表达量也呈升高趋势，且与番石榴叶总黄酮的剂量呈相关性。
　　结论：1.DM模型小鼠的胰岛细胞破坏严重，空腹血糖水平显著升高，胰腺组织中与胰岛再生有关的相关转录因子表达水平明显下降。2.番石榴叶总黄酮能显著降低DM小鼠的血糖水平，减轻胰岛细胞破坏，且能上调DM小鼠胰腺组织中与胰岛发育有关的相关转录因子表达水平。3.番石榴叶总黄酮对DM小鼠受损的胰岛具有促进再生作用，且其机制可能与上调调控胰岛β细胞再生相关转录因子的表达有关。

目录

声明

缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、DM小鼠模型的制备

1.1对象和方法

1.2 结果

1.3讨论

1.4小结

二、番石榴叶总黄酮的提取

2.1材料与仪器

2.2实验方法

2.3实验结果

2.4讨论

2.5小结

三、番石榴叶总黄酮药效学研究

3.1对象与方法

3.2结果

3.3讨论

3.4小结

四、番石榴叶总黄酮促进胰岛β细胞再生机制研究

4.1 HE染色法观测胰岛形态学改变

4.2免疫组化学法检测PDX-1表达

4.3 RT-PCR法检测胰岛发育相关转录因子表达

4.4 Western blot测定胰岛发育相关转录因子的表达

五、讨论

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

附录

综述:胰岛发育相关转录因子与胰岛再生

致谢

个人简历