乳腺癌中CAFs通过旁分泌效应诱导肿瘤转移的表观遗传学分子机制研究

摘要

目的:
　　肿瘤转移是导致乳腺癌患者死亡的重要原因之一。基质细胞和肿瘤细胞的相互作用在促进肿瘤生长和维持肿瘤的恶性表型中发挥重要作用。癌相关成纤维细胞（CAFs）作为基质细胞中最重要的成员之一，通过旁分泌效应，即产生多种生长因子、趋化因子等信号分子促进肿瘤发生和转移，但是，其具体的分子机制和参与这些过程的分子介体尚不明了。相关研究表明，表观遗传学机制的改变，尤其是组蛋白修饰、染色质重塑及非编码RNA调控等实现对靶基因的调控，在诱发肿瘤转移中扮演重要角色。
　　本研究主要阐明乳腺癌中CAFs介导肿瘤细胞转移的关键作用因子，以及CAFs诱导的肿瘤细胞中表观遗传学修饰的改变及相关的分子机制，为乳腺癌的治疗提供新的靶点。
　　方法:
　　1.以乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7为模型，分为下列五组条件培养：空白对照、TGF-β1刺激处理、CAFs-CM处理、CAFs-CM联合TGF-β1抑制剂（SB431542）处理、CAFs-CM联合吡非尼酮（PFD）处理。ELISA检测细胞上清液中TGF-β1的浓度水平；Western Blot和IF检测蛋白质的表达水平及分布；Transwell和Wound Healing Assay检测细胞侵袭和迁移能力；Real-time PCR检测对照组与CAFs-CM处理组之间多种lncRNA的表达水平；Real-time PCR和FISH检测上述五组细胞中HOTAIR的表达水平。以乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7为模型，分为下列三组条件培养：空白对照、CAFs-CM处理、CAFs-CM联合shHOTAIR处理。Transwell检测细胞侵袭能力；IF检测蛋白质的表达水平及分布；
　　2.生物信息学分析预测HOTAIR启动子区域SMAD结合位点；ChIP检测蛋白质H3K27me3、EZH2与CDK5RAP1、Egr-1及蛋白质SMAD2/3/4与HOTAIR的相互作用关系。
　　3.构建MDA-MB-231裸鼠乳腺癌原位肿瘤模型。将上述细胞分为control组、CM组、CM-shHOTAIR组经过转染luciferase慢病毒，接种至裸鼠乳腺脂肪垫上，建立裸鼠乳腺癌原位肿瘤模型。进行体内研究HOTAIR对CAFs诱导的肿瘤转移的影响。小动物活体成像技术检测肿瘤大小及肺转移的荧光信号；H&E染色鉴定是否发生肿瘤的肺转移；IHC检测β-catenin、EZH2、H3K27me3、p-SMAD2、p-SMAD3等表达情况；FISH检测石蜡切片组织中HOTAIR的表达水平。
　　4.利用FISH和IHC检测59例临床获取的浸润性乳腺转移癌及原位导管癌中HOTAIR和FAP-α、α-SMA、CDK5、CDK5RAP1、EZH2、Egr-1的表达水平，研究其表达量和肿瘤转移及预后不良之间的相关性。
　　结果:
　　1.在乳腺癌进展期间，CAFs通过分泌适宜癌细胞生长及转移的信号分子，诱导肿瘤转移。通过ELISA实验对四组细胞的上清液中TGF-β1的水平进行检测，与对照细胞相比，CAFs-CM处理组细胞的上清液中总TGF-β1水平显着升高。Western Blot结果显示，TGF-β1刺激处理组和CAFs-CM处理组的癌细胞中p-SMAD2和p-SMAD3蛋白质水平均显着升高，在TGF-β1抑制剂SB或PFD处理的细胞的中检测到p-SMAD2和p-SMAD3蛋白质水平显著降低，表明CAFs诱导TGF-β1/SMAD信号通路的活化。此外，在CAFs-CM联合SB和PFD处理的细胞中也检测到β-catenin、vimentin表达上升和E-cadherin表达下降。IF结果显示，TGF-β1刺激处理组和CAFs-CM处理组的癌细胞中观察到F-actin的重塑和极化，而在CAFs-CM联合SB或PFD处理后，应力纤维数目显著降低。另外，在CAFs-CM联合SB或PFD处理的肿瘤细胞中，CAFs对肿瘤细胞迁移和侵袭活性的促进作用显著削弱。这些结果表明TGF-β1是介导CAFs和乳腺癌细胞之间相互作用的关键分子。
　　2.CAFs通过激活TGF-β1/SMAD通路刺激肿瘤细胞的侵袭型表型。同时lncRNA在表观遗传学水平的调控对肿瘤细胞的发生发展同样起到重要作用。通过Real-time PCR检测肿瘤细胞中多种lncRNA的mRNA水平，结果显示，与对照组细胞相比，CAFs-CM引起lncRNA变化中HOTAIR的表达最高。进而对各处理组肿瘤细胞中HOTAIR的mRNA水平进行Real-time PCR检测，结果显示，与CAFs-CM处理组相似，TGF-β1刺激处理组也诱导HOTAIR表达水平的升高。然而，在CAFs-CM联合SB或PFD处理的肿瘤细胞中，CAFs对肿瘤细胞HOTAIR表达的促进作用显著削弱。FISH结果同样显示CAFs-CM联合SB或PFD削弱CAFs-CM诱导的HOTAIR的表达及转位入核。Western Blot结果显示，CAFs-CM处理组EZH2和H3K27me3蛋白质水平显著升高。此外，HOTAIR敲低细胞中观察到vimentin、β-catenin的下降和E-cadherin的上升。Transwell检测HOTAIR的敲降能够减少入侵细胞的数量。基于这些数据，我们证明CAFs通过TGF-β1激活癌细胞中的HOTAIR表达来实现转移功能。
　　3.HOTAIR是TGF-β1/SMAD途径的转录靶标。已知TGF-β1组装激活Smads的受体复合物，Smads组装调节转录的多亚单位复合物。Real-time PCR显示用SMAD2，SMAD3， SMAD4 siRNA转染的细胞中HOTAIR mRNA显著减少。此外，免疫荧光图像表明在shHOTAIR组中观察到降低的SMAD2/3核染色丧失。启动子分析表明HOTAIR启动子区域中的存在SMAD结合位点。ChIP实验结果表明CAFs刺激SMAD2和SMAD3与HOTAIR启动子区的直接结合。根据这些结果，我们基于CAFs促进肿瘤转移的表观遗传机制的作用，我们阐明CAFs通过分泌TGF-β1转录激活肿瘤细胞中的HOTAIR异常表达。HOTAIR是SMAD2/3的转录靶标。
　　4.CAFs通过靶向CDK5信号诱导EMT。我们之前的结果表明，通过激活CDK5激酶活性的形式引起肿瘤转移。与我们以前的研究一致，重组TGF-β1或CAFs-CM处理的细胞中CDK5蛋白表达显着增加，而Egr-1和CDK5RAP1大大降低。此外，癌细胞中CDK5的敲低阻断CAFs或重组TGF-β1诱导的EMT。此外，shHOTAIR治疗未能使CAFs介导的EMT在CDK5过表达的癌细胞中受到影响。通过ChIP分析CDK5RAP1和Egr-1启动子上的组蛋白甲基化标记显示，与对照组细胞相比，CAFs-CM处理的MDA-MB-231和MCF-7细胞H3K27me3在上述两种基因的启动子上高度富集。同时HOTAIR的敲降削弱CAFs的执行功能，CDK5RAP1和Egr-1启动子的H3K27me3水平显着降低。此外，检测了EZH2对CDK5RAP1和Egr-1启动子的募集，结果表明CDK5RAP1和Egr-1启动子的PRC2成分水平显着降低。基于这些数据，我们验证了CDK5的激活是CAFs介导的EMT的重要的途径。CAFs通过H3K27三甲基化对CDK5RAP1和Egr-1的沉默进而促进激活CDK5表达。并且CAFs通过靶向CDK5信号传导HOTAIR表达诱导EMT。
　　5.为了研究CAFs在体内诱导肿瘤生长和转移的表观遗传学机制，在裸鼠中进行MDA-MB-231原位肿瘤移植模型。每周监测生物发光成像，表明CAFs明显促进原发性肿瘤生长，而shHOTAIR治疗诱导肿瘤体积显着降低。最重要的是，CAFs导致剧烈的肺转移，与对照细胞相比，发现了广泛的肿瘤灶，如通过定量生物发光图像所确定的。然而，当HOTAIR被敲降时，这种转移特征被减弱。H＆E染色进一步证实了结果。与对照组比较，CAFs通过FISH显示，增强了HOTAIR的核染色，进一步证实了我们的体外研究。免疫组织化学染色显示，在shHOTAIR组检测到核β-catenin的下调以及p-SMAD2，p-SMAD3，EZH2和H3K27me3阳性细胞的减少。综合来看，shHOTAIR治疗有效地阻止了CAFs和肿瘤细胞之间的交流，从而削弱了CAFs诱导的EMT。总之，这些实验支持CAFs分泌TGF-β1在乳腺癌细胞中激活TGF-β1/SMAD途径，导致HOTAIR的转录上调和CDK5信号通路的组蛋白修饰，从而促进乳腺癌症进展和转移。
　　6.为了进一步了解CAFs在乳腺癌临床相关中的作用，我们收集了59例乳腺癌及原位癌患者，并通过免疫组织化学法检测了CAFs的标志物FAP-α和α-SMA。我们发现与原位导管癌相比，侵袭性乳腺癌中FAP-α和α-SMA的表达水平显着上调，表明CAFs促进了乳腺癌患者的肿瘤转移。与原位导管癌相比，通过FISH图像显示，在转移性乳腺癌中观察到更高表达的HOTAIR和更多的细胞核染色，表明HOTAIR的上调与肿瘤转移密切相关。
　　结论:
　　在这里，我们发现CAFs通过分泌细胞因子TGF-β1诱导CDK5RAP1/Egr-1基因启动子区域组蛋白3赖氨酸27位三甲基化进而激活CDK5信号通路，这与之前研究证明的CAFs促肿瘤转移特性相符。我们发现CAFs通过TGF-β1/SMAD信号激活癌细胞中长非编码RNA HOTAIR的表达和促进上皮间质转化（EMT）。并且CAFs引起的乳腺癌细胞HOTAIR的上调是其激活CDK5信号通路所必需的。CAFs通过分泌TGF-β1转录激活HOTAIR。HOTAIR的敲低能够削弱CAFs诱导的乳腺癌细胞侵袭性增强及裸鼠肺转移。HOTAIR和CDK5的表达在乳腺癌进展期间上调，并与淋巴结转移密切相关。此外，发现在FAP-α，CDK5和HOTAIR之间存在显著的相关性，进一步证实了我们的工作模型，CAFs分泌TGF-β1转录激活HOTAIR进而激活CDK5信号通路，从而行使促转移活性，使TGF-β1/SMAD/HOTAIR轴作为标靶用于乳腺癌治疗变为可能。在乳腺癌进展期间，CAFs提供适当的信号，可以形成癌细胞的侵袭性表型，建立一个复杂的环境，最终导致转移。显然，TGF-β1信号通路的过度活化有助于代谢重编程CAFs的激活。此外，TGF-β1已经与不良的临床结果相关联，并且是CAFs介导的有效转移起始所需的。与这些结果一致，我们的数据进一步认为，CAFs的关键促转移功能依赖于TGF-β1分泌。阻断TGF-β1分泌可以有效地消除CAFs的功能。在本研究中，我们证明CAFs通过诱导CDK5RAP1/Egr-1启动子中的组蛋白三甲基化促进细胞迁移和侵入，导致活性CDK5信号通路传导。并且这种修饰与EZH2，PRC2复合物的H3K27甲基转移酶催化亚基的功能密切相关。我们实验证明CAFs刺激HOTAIR表达，导致在CDK5RAP1和Egr-1启动子区域EZH2的募集和结合能力增强以及H3K27介导的三甲基化的大幅度增加，从而激活CDK5表达。
　　此外，虽然我们的研究集中于TGF-β1，但CAFs可分泌另外的促转移因子如IL-6，IGF-II的混合物以促进癌症进展。因而，其他参与乳腺癌发展的关键LncRNA仍有待调查。可以想象，CAFs编排多个非编码RNA和信号通路以控制乳腺癌进展过程中的几个生物过程。我们的研究揭示CAFs诱导肿瘤生长和转移的新机制，发现TGF-β1/HOTAIR轴控制乳腺癌的发展和进展，并将这些分子作为乳腺癌治疗的目标。

目录

声明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、CAFs旁分泌效应诱导肿瘤转移机制的体外研究

1.1 实验材料

1.2 实验方法

1.3 结果

1.4 讨论

1.5 小结

二、CAFs旁分泌效应诱导肿瘤转移机制的体内研究

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 结果

2.4 讨论

2.5 小结

三、乳腺癌中CAFs/HOTAIR与肿瘤转移及预后的相关性分析

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 结果

3.4 讨论

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:应力转导和YAP相关基质重塑对CAFs的发生和维持

致谢

个人简历