基于蛋白质组学技术研究氢气治疗脓毒症小鼠急性肺损伤的分子机制

摘要

目的：临床上脓毒症是指机体对感染反应失调而导致危及生命的器官功能障碍，肺是易累及的器官之一。本课题组前期研究表明，氢气可减轻脓毒症小鼠急性肺损伤(acute lung injury, ALI)，有效改善脓毒症小鼠的生存率和器官功能。其机制与抑制炎症反应、氧化应激反应和细胞凋亡等有关，但具体分子机制仍未完全阐明。蛋白质组学可对参与特定生理或病理状态的所有蛋白变化进行分析，有助于全面阐明氢气减轻脓毒症 ALI的分子机制。本文拟基于蛋白质组学技术研究氢气治疗脓毒症小鼠 ALI的分子机制，为研发脓毒症患者的救治新策略奠定科学基础。
　　方法：成年雄性ICR小鼠，6周龄，体重20～25 g，采用随机数字表法，将其分为4组：假手术组（Sh组）、假手术+氢气组（Sh+H2组）、脓毒症组（S组）和脓毒症+氢气组（S+H2组）。采用盲肠结扎穿孔法（CLP）制备脓毒症小鼠模型。Sh+H2组及S+H2组于CLP术后1、6 h时各吸入2%氢气1 h。观察四组小鼠假手术或CLP术后7 d生存率。于假手术或CLP术后24 h时，麻醉下处死各组小鼠，取肺组织，液氮速冻后保存于－80℃冰箱，用于同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)和液质联用-串联质谱分析(LC-MS/MS)，筛选与氢气治疗脓毒症小鼠ALI相关的差异表达蛋白。对差异表达蛋白进行GO功能注释、KEGG富集分析及STRING蛋白质互作网络等高级生物信息分析。采用Western blot法测定差异蛋白的表达水平，验证蛋白质组学结果。
　　结果：Sh组和Sh+H2组小鼠7 d生存率为100%。S组小鼠7 d生存率为10%， S+H2组小鼠生存率为50%，和Sh组相比均明显降低（P<0.05），且S组和S+H2组小鼠均有不同程度的病理生理学变化，如毛发粘连成缕，稀便，活动量减少，呼吸频率增加等。和S组相比，S+H2组小鼠生存率明显提高（P<0.05）。对假手术或CLP后24 h时各组小鼠肺组织进行蛋白质组学分析，共鉴定到5688个蛋白质，其中4772个蛋白质可定量，将诱导小鼠脓毒症ALI和H2治疗两个实验条件结合起来，在两两组比较结果的基础上进行关联分析，共筛选出192个蛋白与吸入氢气减轻脓毒症时ALI有关。对192个差异蛋白进行高级生物信息分析，GO的注释与功能分析结果显示，192个氢气治疗相关的差异蛋白主要参与了运转活性、内肽酶活性调节、丝氨酸内肽酶抑制剂活性、氧结合、四吡咯结合、肽酶抑制剂活性、内肽酶抑制剂活性、血红素结合、氧运转活性和酶抑制剂活性10个分子功能，其中有5个氧运输相关的分子功能显著富集。192个氢气治疗相关的差异蛋白所在的细胞位置主要为胞外区、胞外区部分、血红蛋白复合物、细胞外基质、肌节、收缩纤维部分、肌原纤维、收缩纤维、血液微粒和细胞外间隙。其中差异蛋白显著富集于4个细胞外的细胞位置和4个与肌肉纤维相关的细胞位置。192个氢气治疗相关的差异蛋白主要参与的生物过程为氧运输、四吡咯代谢过程、水解酶活性的负调控、心脏收缩、横纹肌收缩、金属离子反应、含卟啉化合物代谢过程、心脏过程、肌肉收缩和肌肉系统过程，其中共有4个肌肉收缩相关的生物过程。STRING的注释与功能分析结果涉及6个核糖体蛋白、10个肌球蛋白与肌钙蛋白、7个胶原蛋白与粘附蛋白和10个凝血相关蛋白的蛋白质互作网络。于假手术或CLP后24 h时，与Sh组比较，S组小鼠肺组织Sema7A、OTULIN和MAP3K1表达上调，TRF表达下调（P＜0.05）；与S组比较，S+H2组小鼠肺组织Sema7A、OTULIN和 MAP3K1表达下调，TRF表达上调（P＜0.05）。Western blot法测定Sema7A、TRF、OTULIN和MAP3K1四个蛋白的表达趋势，与蛋白质组学分析结果一致。
　　结论：2%氢气吸入可明显提高脓毒症ALI小鼠的7 d生存率。应用iTRAQ联合LC-MS/MS的蛋白质组学技术共筛选出Sema7A、TRF、OTULIN和MAP3K1在内的192个差异表达蛋白，参与了氧运输、肌肉收缩、蛋白质合成、细胞骨架、微循环与血管内皮屏障、凝血系统等生化代谢途径，涉及PI3K-Akt等信号通路，在氢气治疗脓毒症小鼠ALI的分子机制中发挥重要作用。

目录

声明

缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、利用蛋白质组学技术筛选氢气治疗脓毒症ALI相关的差异蛋白

1.1对象和方法

1.2结果

1.3讨论

1.4小结

二、差异蛋白的高级生物信息分析和Western Blot验证

2.1对象和方法

2.2 结果

2.3讨论

2.4小结

结论

创新点

不足之处

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述: 蛋白质组学在脓毒症研究中的应用

致谢

个人简历