间充质干细胞治疗实验性自身免疫性甲状腺炎的凋亡机制研究

摘要

目的：
　　通过建立稳定的C57BL/6小鼠实验性自身免疫性甲状腺炎模型（Experimental autoimmune thyroiditis，EAT），给予间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）治疗EAT，阐明MSCs对EAT的治疗效果与作用，为MSCs的临床应用和自身免疫甲状腺炎（Autoimmune thyroiditis，AIT）的治疗与预防研究提供理论基础与实验依据。
　　方法：
　　1.建立小鼠EAT模型。分别在第1天与第14天，对雌性C57BL/6小鼠给予猪甲状腺球蛋白和完全弗氏佐剂混合溶液和猪甲状腺球蛋白与不完全弗氏佐剂混合溶液，建立EAT小鼠模型。并通过甲状腺组织病理学检测、脾脏指数及相关甲状腺自身抗体的表达，判断模型建立效果。
　　2.MSCs治疗EAT模型小鼠。从一周龄小鼠骨实质中分离培养MSCs，倒置光学显微镜，观察细胞形态，并采用流式细胞术检测分离培养获得的MSCs细胞表型。EAT模型建立成功后，分别在第0天、第14天尾静脉移植MSCs，并通过比较移植后各组小鼠甲状腺的HE染色结果，脾脏指数改变情况，血清甲状腺自身抗体TPOAb、TgAb、TMAb含量，以及流式细胞术检测EAT模型组和MSCs治疗组脾细胞免疫功能的改变，判断MSCs对EAT小鼠的治疗效果。
　　3．MSCs治疗EAT的作用机制研究。免疫组织化学法和免疫荧光法检测EAT小鼠甲状腺组织的凋亡病变情况。Q-PCR检测正常对照组、EAT模型组、MSCs治疗组和MSCs中凋亡因子的表达情况。通过对治疗组小鼠输注荧光示踪剂CM-Dil标记的MSCs，病理组织切片法结合免疫荧光细胞计数检测MSCs的归巢能力。体外鉴定MSCs防护EAT小鼠甲状腺组织凋亡的作用机制。
　　结果：
　　1.采用多点多部位皮下注射猪甲状腺球蛋白和两种弗氏佐剂，成功建立小鼠EAT模型。
　　2.分离培养MSCs，倒置显微镜下观察到细胞成长梭形，成纤维细胞样，流式细胞术结果表明MSCs均高表达干细胞表面相关标记。MSCs治疗EAT小鼠后，病理组织学HE染色结果表明，MSCs治疗组小鼠与模型组小鼠的甲状腺组织均可见不同程度甲状腺滤泡的破坏及淋巴细胞的浸润，但治疗组小鼠，病变程度均较轻，无明显滤泡细胞结构性破坏。3组小鼠脾脏指数无统计学差异。ELISA法检测结果表明，MSCs治疗组甲状腺微粒体抗体、甲状腺过氧化物酶抗体、甲状腺球蛋白抗体表达水平均显著低于EAT模型小鼠。流式细胞术检测EAT模型小鼠和MSCs治疗组小鼠脾脏细胞中CD4+T细胞，CD8+T细胞的表达情况，结果表明，MSCs治疗后，相较于EAT模型组，小鼠脾脏细胞CD4+T细胞/CD8+T细胞比例发生改变。
　　4.免疫组化及免疫荧光染色结果表明，EAT模型组小鼠的甲状腺组织细胞发生凋亡，MSCs治疗组小鼠甲状腺组织内的Fas凋亡通路下游Caspase3的蛋白表达水平显著低于EAT模型组，Q-PCR检测结果表明，EAT模型组内表达大量的FasL。而MSCs和正常对照组小鼠甲状腺组织高表达凋亡受体Fas。荧光示踪结果显示MSCs可有效归巢至炎性发生的甲状腺组织。体外共培养结果证实，EAT模型小鼠脾淋巴细胞能够作用于正常小鼠甲状腺组织，诱导凋亡因子Caspase3、Caspase6和Bcl-2高表达，引发细胞凋亡，而MSCs可有效阻止EAT模型小鼠脾淋巴细胞对正常小鼠甲状腺组织的促凋亡作用。
　　结论：
　　MSCs能够有效归巢到炎症发生的甲状腺组织，通过表达Fas受体，阻止EAT模型小鼠的CD8+淋巴细胞对甲状腺组织进行的杀伤作用与诱导凋亡作用，进而对甲状腺组织细胞进行保护，抑制自身免疫紊乱引起的甲状腺损伤，从而延缓实验性自身免疫性甲状腺炎的疾病进展。

目录

声明

缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、小鼠实验性自身免疫性甲状腺炎模型建立

1.1对象和方法

1.2结果

1.3讨论

1.4小结

二、间充质干细胞治疗实验性自身免疫性甲状腺炎

2.1对象和方法

2.2结果

2.3 讨论

2.4 小结

三、MSC防治实验性自身免疫性甲状腺炎的作用机制研究

3.1对象和方法

3.2结果

3.3 讨论

3.4 小结

结论

1.成功建立EAT小鼠模型及分离培养鉴定MSCs

2. MSCs对EAT小鼠具有治疗效果

3.MSCs通过抑制Fas/FasL介导的凋亡途径激活防治EAT小鼠的甲状腺组织损伤发展

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:间充质干细胞治疗自身免疫性甲状腺疾病的研究现状与前景

致谢

个人简历