复活草提取物对雪旺细胞缺氧后BDNF分泌及AQP1表达的影响

摘要

目的：
　　水通道蛋白（Aquaporins，AQPs），又名水孔蛋白，是一类高度保守的膜蛋白[1，2]，能够介导细胞的跨膜转运，并且各类亚型之间有十分相近的蛋白序列及三维结构。以往研究证明AQPs表达于中枢神经系统，很少有研究证明AQPs表达于周围神经系统。近几年才有研究证明AQP1，AQP2和AQP4均表达于胶质细胞，AQP1是周围神经系统表达最多的水通道蛋白[3]。并发现 AQP1定位在周围神经系统的雪旺细胞内，雪旺细胞中APQ1的表达类似于星形胶质细胞中AQP4的表达。本实验目的之一即探索周围神经损伤后水肿与水通道蛋白的表达关系。
　　周围神经损伤后细胞缺氧，神经水肿，缺氧诱导因子1（HIF-1α）相应地表达增加[4,5]，但是对于周围神经损伤后AQP1与HIF-1α表达变化以及何种相关性具体还不明确，本实验目的三即探索二者之间的关联。
　　近来关于修复周围神经损伤的药物报道较少，并且治疗效果不理想，本实验目的三即探索复活草提取物对雪旺细胞缺氧损伤后AQP1及HIF-1α的调节作用，探索复活草提取物对于神经损伤的修复作用。
　　方法：
　　1、SD乳鼠面神经提取原代雪旺细胞。取SD乳鼠8只，雌雄不限，3-5天，以酶消化法对雪旺细胞进行原代培养，以差速贴补法进行提纯，并且以免疫荧光共标染色鉴定雪旺细胞标记物（S-100）及AQP1蛋白的表达，以此证明AQP1表达于周围神经系统的雪旺细胞膜上。
　　2、制作雪旺细胞缺氧模型。以不同浓度的CoCl2（0ul/ml、2ul/ml、4ul/ml、6ul/ml、8ul/ml、10ul/ml）孵育贴壁细胞，显微镜下观察24小时细胞形态变化并拍照；收集不同浓度细胞蛋白，westernblot检测AQP1表达程度，并以GraphPad Prime5定量分析AQP1含量。从而确定最佳CoCl2浓度进行后续试验。
　　3、确定复活草提取物的适宜浓度。以不同浓度的复活草提取物（0.5ul/ml、1ul/ml2.5ul/ml、5ul/ml、10ul/ml）孵育贴壁的SCs，24小时后进行CCK-8检测。OD值分析雪旺细胞增殖情况并绘制表格及折线图进行分析。
　　4、探索复活草提取物对雪旺细胞损伤的修复作用。选取最适宜浓度的CoCl2及复活草提取物进行后续试验，分三组：空白对照组、缺氧模型组、复活草提取物修复组。?取贴壁完全的细胞进行划痕试验，观察24h、48h细胞迁移情况并拍照。?三组细胞观察7天，western blot检测7天的细胞AQP1及HIF-1α变化。
　　结果：
　　1、成功培养出原代雪旺细胞，荧光染色证明AQP1表达于雪旺细胞膜上。
　　2、选取6ul/mlCoCl2为最适缺氧浓度。作用24小时后雪旺细胞胞体明显变圆，轴突皱缩。且western blot检测AQP1蛋白表达含量最高。
　　3、选取2.5ul/ml为复活草提取物适宜浓度。CCK-8方法检测细胞增殖，酶标仪测定在450nm处的吸光度值，统计方法分析，复活草提取物组相对于空白对照组，1-4天OD值分析，P>0.05，差异无统计学意义，即加入复活草提取物后细胞增殖不明显。5-7天OD值分析，P<0.05差异有统计学意义，即加入复活草提取物后细胞增殖明显。
　　4、选取复活草提取物浓度为2.5ul/ml，CoCl2浓度为6ul/ml。实验分三组：空白对照组、缺氧模型组、复活草提取物修复组。?细胞划痕实验观察细胞迁移能够促进细胞增殖。24小时划痕长度与0小时划痕长度的比值来确定细胞迁移的程度，结果显示相对于空白对照组及缺氧组，P<0.05，复活草提取物能明显促进细胞迁移。缺氧组对于空白对照组，P>0.05，结果无明显统计意义。?western blot检测7天AQP1与HIF-1α蛋白表达，细胞损伤时AQP1与HIF-1α表达均增加，结果证明复活草提取物能明显下调AQP1及HIF-1α的表达。
　　结论：
　　1、雪旺细胞的水转运受AQP1的调节。
　　2、面神经缺氧水肿与AQP1表达变化有关。
　　3、制作CoCl2缺氧模型模拟细胞损伤，细胞缺氧，HIF-1α表达增加，从而诱导AQP1表达增加。
　　4、复活草提取物促进细胞增殖与迁移，并且能够降低HIF-1α与AQP1的表达证明复活草提取物能够明显减轻细胞缺氧程度，并且能够减轻由缺氧引起的细胞水肿。

目录

声明

缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

第一部分、雪旺细胞的提取与鉴定

一 材料与方法

二 结果

三 讨论

四 小结

第二部分、缺氧模型的制作及复活草提取物浓度的确定

一 材料与方法

二 结果

三 讨论

四 小结

第三部分、复活草提取物对雪旺细胞损伤后修复作用

一 实验材料与方法

二 结果

三 讨论

四 小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:雪旺细胞对周围神经损伤修复的研究进展

致谢