子宫内膜再生细胞在溃疡性结肠炎模型中免疫调节的相关机制研究

摘要

目的：本课题探讨子宫内膜再生细胞（ERC）在溃疡性结肠炎（UC）小鼠模型中免疫调节的作用及相关机制。自经血中分离鉴定 ERC，观察其表面程序性死亡受体-配体1（PD-L1）的表达情况；建立UC的小鼠动物模型；探讨ERC在UC小鼠模型体内的分布情况；将ERC应用于UC的体内体外实验，研究ERC细胞表面的PD-L1免疫调节分子在UC治疗中的作用。
　　方法：1）以月事杯收集健康育龄期女性志愿者的月经血，利用标准的Ficoll方法分离月经血样品中的单个核细胞，进行细胞培养，应用流式细胞术鉴定 ERC的表面抗原。2）选用SPF级的BALB/c小鼠，将其饮用不同浓度的葡聚糖硫酸钠（DSS）溶液建立UC小鼠动物模型，观察造模期间实验动物的一般情况、疾病活动指数（DAI）及组织病理学改变，选择最佳的 DSS浓度并对小鼠动物模型进行评估。3）应用PKH26（Paul Karl Horan26）对ERC进行体外标记，将标记后的ERC应用于UC动物模型，观察ERC在UC动物模型体内的分布情况。4）应用PD-L1抗体对ERC细胞表面的PD-L1进行封闭，在体内实验中，将ERC及PD-L1抗体封闭后的ERC应用于UC动物模型（分为四组，①正常对照组：自由饮用不含DSS的饮用水；②未治疗组：自由饮用3%DSS溶液+经静脉注射PBS缓冲液；③ERC组：自由饮用3%DSS溶液+静脉注射以PBS缓冲液重悬的ERC；④PD-L1封闭的ERC组：自由饮用3%DSS溶液+静脉注射以PBS缓冲液重悬的PD-L1封闭的ERC），第2、5、8天，ERC组经尾静脉注射ERC（1×106/0.2ml/只），PD-L1封闭的ERC组经尾静脉注射PD-L1封闭的ERC（1×106/0.2ml/只），第8天，所有组均改为饮用水，实验期间每天观察并记录各组实验动物的一般状况，进行DAI评分，第15天，处死全部小鼠，测量自然状态下结直肠长度，显微镜下观察结直肠的病理改变，采用流式细胞术检测脾脏 CD3+CD4+T、CD3+CD8+T、 CD4+CD25+Foxp3+Tregs、 CD11c+MHC-II+DCs、 F4/80+M、F4/80+CD206+M细胞数量；采用ELISA及qPCR的方法检测结直肠正常组织及病变组织 TNF-α、IFN-γ、IL-10、TGF-β的蛋白水平及 mRNA转录水平。在体外实验中，从正常小鼠中分离脾细胞，将ERC与脾细胞进行共培养或者将PD-L1封闭的ERC与脾细胞进行共培养，应用不同的细胞刺激因子对脾细胞进行刺激（分为四组，①未治疗组：单纯脾细胞培养；②ERC治疗组：ERC与脾细胞进行共培养；③PD-L1封闭的ERC治疗组：PD-L1封闭的ERC与脾细胞进行共培养；④transwell培养组：ERC与脾细胞进行非接触的共培养），应用流式细胞术分析不同组中 CD3+CD4+T、CD3+CD8+T、CD4+CD25+Foxp3+Tregs、CD11c+MHC-II+DCs、F4/80+M、F4/80+CD206+M细胞的数量；分析上述指标的变化，评价PD-L1在ERC治疗小鼠UC中的作用。
　　结果：1）ERC能够表达PD-L1、CD90、CD105，不表达CD34、CD45；随着刺激因子IFN-γ浓度的增加，ERC表面的PD-L1表达相应增加。2）随着DSS浓度的增加及造模时间的延长，造模小鼠的一般状况逐渐变差、进食进水逐渐减少、体重逐渐下降、DAI评分逐渐增加，小鼠的病死率增加，其病理学改变包括：粘膜固有层中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞的浸润，腺窝扭曲变形，固有层增厚，粘膜下层淋巴滤泡形成，小鼠肠道的炎症逐渐加重。3）将 PKH26荧光标记的ERC于造模第5天经尾静脉注入UC小鼠动物模型体内，在ERC注入48h时进行组织取材，荧光显微镜观察显示荧光强度为肺脏＞肝脏＞脾脏＞结肠组织，肾脏没有观察到荧光，模型组结直肠病变组织荧光强度高于正常组结直肠组织的荧光强度。4）体内实验显示，尾静脉注射ERC对小鼠结直肠炎症有明显的保护作用，封闭ERC表面的PD-L1明显降低ERC对小鼠的结直肠炎症保护作用；与未治疗组比较，ERC组脾脏CD3+CD4+T、CD3+CD8+T细胞数量明显减少（P＜0.05），CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞数量明显增加（P＜0.05）， CD11c+MHC-II+DCs细胞数量显著减少（P＜0.05），F4/80+M细胞数量明显减少（P＜0.05），F4/80+CD206+M相对增加（P＜0.05），结直肠病变组织内TNF-α、IFN-γ的mRNA转录水平及蛋白表达水平降低（P＜0.05），IL-10、TGF-β的mRNA转录水平及蛋白表达水平升高（P＜0.05）；与ERC组相比，PD-L1封闭的ERC治疗组脾脏 CD3+CD4+T、CD3+CD8+细胞数量相对增加（P＜0.05）、CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞数量相对减少（P＜0.05）、CD11c+MHC-II+DCs细胞数量相对增加（P＜0.05），结直肠组织内TNF-α、IFN-γ的mRNA转录水平及蛋白表达水平相对增加（P＜0.05），IL-10、TGF-β的mRNA转录水平及蛋白表达水平相对减少（P＜0.05）。体外实验显示，与正常对照组相比，经不同的刺激因子刺激后，ERC共培养组CD3+CD4+T、CD3+CD8+T、CD11c+MHC-II+DCs、F4/80+M细胞数量相对减少，CD4+CD25+Foxp3+Tregs、F4/80+CD206+M细胞数量相对增加；PD-L1封闭的ERC共培养组与ERC共培养组相比，CD3+CD4+T、CD3+CD8+T、 CD11c+MHC-II+DCs、 F4/80+M细胞数量相对增加， CD4+CD25+Foxp3+Tregs、F4/80+CD206+M细胞数量相对减少；transwell培养组与ERC共培养组相比，CD3+CD4+T、CD3+CD8+T、CD11c+MHC-II+DCs、F4/80+M细胞数量相对增加，CD4+CD25+Foxp3+Tregs、F4/80+CD206+M细胞数量相对减少。
　　结论：1）自经血中分离的ERC是一种类似于MSC的再生细胞，ERC不但来源丰富、获取无创，而且ERC表面表达在诱导免疫耐受方面发挥重要作用的免疫调节分子PD-L1。2）3%的DSS为构建BALB/c小鼠UC动物模型的理想浓度，该浓度不但能够很好的模拟人UC肠道病理改变，而且没有小鼠的病死发生。3）将ERC通过小鼠尾静脉注入UC模型小鼠体内后，ERC能够向肠道炎症部位迁移，而且ERC在肠道的分布高于正常对照组。4）PD-L1在ERC有效控制UC动物模型肠道炎症的发生发展中发挥重要作用，体内体外实验均显示ERC通过PD-L1抑制DCs的成熟分化及CD4+T和CD8+T细胞的增殖、促进Tregs细胞及M2细胞的产生，并且体外实验中还显示ERC表面的PD-L1通过直接接触的方式起作用，进而发挥免疫调节的作用。

目录

声明

缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、子宫内膜再生细胞的分离、培养、鉴定及保存

1.1对象和方法

1.2结果

1.3讨论

1.4小结

二、DSS诱导的UC小鼠模型的建立

2.1对象和方法

2.2结果

2.3讨论

2.4小结

三、子宫内膜再生细胞在UC小鼠动物模型体内的分布

3.1对象和方法

3.2结果

3.3讨论

3.4小结

四、PD-L1在ERC缓解DSS诱导的UC动物模型中的作用

4.1对象和方法

4.2结果

4.3讨论

4.4小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:子宫内膜再生细胞研究进展

致谢