间充质源性肝细胞生长因子通过抑制Smad4支持肺祖细胞的增殖

摘要

目的：在小鼠肺上皮祖细胞和小鼠成纤维细胞体外3D共培养的情况下，研究TGFβ-HGF-Smad4轴对小鼠肺上皮祖细胞增殖的影响。 方法：首先，通过qPCR方法研究SB431542对成纤维细胞HGF的产生和分泌的影响。然后在无成纤维细胞共培养的情况下加入外源性HGF培养肺祖细胞，进一步证实HGF对肺上皮祖细胞增殖的调控。其次，对小鼠肺组织进行祖细胞分选并培养，分选出肺祖细胞。对分选出的祖细胞进行qPCR检测，检测其是否高表达HGF的受体Met。再次，利用基因芯片技术筛选出肺祖细胞高表达的基因及潜在转录因子。根据基因芯片结果选择Smad4作为研究对象。最后构建Sftpc-Cre;Smad4f/f小鼠模型，对Sftpc-Cre-;Smad4f/f和Sftpc-Cre+;Smad4f/f mice的LPCs进行分选和培养。比较Sftpc-Cre-;Smad4f/f小鼠的肺祖细胞和Sftpc-Cre+;Smad4f/f mice LPCs分别在有无SB431542时克隆形成率的变化。 结果：（1）在成纤维细胞细胞系CCL206的培养过程中加入SB431542，提取MLg细胞总RNA，进行定量PCR分析，发现SB431542能促进MLg细胞产生并分泌HGF。用基本干细胞培养基加上外源性HGF能培养出肺上皮干细胞的克隆球，计算发现其克隆形成率明显高于对照组。 （2）利用流式细胞仪分选小鼠肺上皮祖细胞，提取这些细胞的RNA并进行定量PCR分析，发现上皮祖细胞上的HGF受体Met的表达水平明显高于MLg细胞。 （3）利用Affymetrix基因芯片分析肺上皮祖细胞中高表达的基因及转录因子。发现TGFβ的表达量很高，并且筛选出Smad4这一高表达的转录因子。 （4）成功构建Sftpc-Cre;Smad4f/f小鼠模型，条件性地在肺上皮细胞上敲除Smad4，对敲除Smad4的肺上皮祖细胞进行培养，发现Smad4敲除组克隆形成率明显高于对照组，但与给予SB431542组比较无明显差异。 结论：（1）抑制TGFβ信号通路，能促进成纤维细胞产生并分泌大量的HGF，HGF能促进肺祖细胞克隆形成。撤除与肺干细胞共培养的成纤维细胞，给予外源性HGF，也可以诱导肺祖细胞形成克隆球。HGF在促进肺祖细胞增殖方面具有核心作用。 （2）肺祖细胞广泛表达HGF受体Met，而MLg细胞上Met的表达量明显低于上述细胞。提示成纤维细胞分泌的HGF通过与肺上皮祖细胞上的Met受体结合，并激活下游信号通路，调控肺祖细胞增殖。 （3）Affymetrix基因芯片分析发现肺上皮祖细胞中高表达多种基因，其中就有TGFβ基因及Smad4，尤其是Smad4还是表达量最多的转录因子。提示Smad4在肺上皮祖细胞的调控过程中起重要作用。 （4）在肺上皮祖细胞中敲除Smad4能促进其增殖，其克隆形成率与给予TGFβR2抑制剂SB431542的对照组比无显著差异，提示Smad4可能位于HGF/Met通路下游，TGFβ-TGFβR1/2-HGF-Smad4轴可能在调节肺上皮细胞的稳态过程中起到重要作用。 结论：我们的研究证明，SB431542通过作用于成纤维细胞的TGFβ受体，改变HGF的分泌水平，进而促进肺祖细胞的增殖，Smad4参与了这一过程。

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