依维莫司通过调节小胶质细胞mTORC1信号通路改善血管性认知功能损害

摘要

背景及目的：血管性痴呆(Vascular dementia,VaD)是一种发病率高且危害严重的疾病，是一种因出血性或缺血性脑损伤导致的认知功能障碍的临床综合征。在未来的几十年里，VaD可能会影响越来越多的患者。因血管性痴呆复杂的病理生理变化,使得对其认识非常的有限。小胶质细胞功能紊乱，部分归因于免疫微环境的紊乱，最终导致了认知功能的损害。考虑到雷帕霉素靶蛋白复合体1（mammalian target of rapamycin complex1，mTORC1）在胶质细胞功能中的关键作用，我们的工作重点是讨论是否雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）抑制剂依维莫司（Everolimus，RAD001）能够抑制有害的小胶质细胞功能，从而改变其表现型和改善因慢性脑灌注不足引起的认知障碍。
　　通过利用弹簧圈套扎双侧颈总动脉造成狭窄建立小鼠因血管因素造成的认知障碍模型，利用水迷宫实验（Morris water maze，MWM）对小鼠进行认知功能的检测，以评估各组小鼠的学习和记忆功能。采取组织学观察评估小鼠海马区的变化，评估RAD001对认知障碍小鼠的改善作用。另通过测定海马区M1标记物CD16/32、M2标记物CD206、M1型相关炎症因子（CD16，iNOS，TNF-α）、M2型相关炎症因子（IL-10，TGF-β，Arg1）以及CA1区VAChT，ChAT和AChE的变化，探索RAD001的脑保护作用，为改善认知障碍提供新的治疗策略。
　　小窄（BCAS）组、RAD001+BCAS组、假手术组。应用双侧颈总动脉狭窄法制备小鼠血管性痴呆模型。我们给双侧颈动脉狭窄的小鼠0.5mg/kg剂量的依维莫司，假手术组的小鼠仅予磷酸盐缓冲溶液(PBS)，作为对照。各组取材前分别进行水迷宫实验；取材后，通过HE染色对海马区的组织结构进行初步评价；通过免疫荧光染色法去评价小鼠的胆碱能活性和lba-1（小胶质细胞/巨噬细胞特异性蛋白），CD16/32, CD206的表达情况；通过蛋白质免疫印迹分析进一步检测M1/M2平衡的机制；通过qRT-PCR检测M1/M2相关炎症因子mRNA在海马的表达情况。
　　结果：1、水迷宫实验获得的结果。在逃避潜伏期的实验中，假手术组和BCAS组分别为：第1天45.1±12s，49.2±12s，P>0.05;第2天40.2±8s，58.1±11s，P<0.05；第3天29.2±8s，57.2±7s，P<0.05；第4天25.1±7s，47.2±6s，P<0.05；第5天20.1±6s，48.3±5s，P<0.01。在目标象限游泳时间百分比的实验中，假手术组和BCAS组分别为：43.52±6.17%，19.85±3.21%，P<0.01。水迷宫检测结果说明双侧颈总动脉狭窄造成了小鼠认知功能障碍。RAD001治疗组与BCAS模型组相比，治疗组逃避潜伏期时间：第3天35.2±5s，第4天26.3±8s，P<0.05；第5天22.2±8s， P<0.01。RAD001治疗组目标象限游泳时间百分比43.59±5.12%，P<0.01。这些结果充分的证明RAD001治疗能够明显改善因慢性脑灌注不足引起的空间障碍。
　　2、HE染色观察到结果：通过HE染色法能够对神经元的缺失进行评估,显示在对小鼠进行双侧颈动脉狭窄处理的最初五周，小鼠海马的CA1区的神经元广泛改变，显微镜下能够清楚地看到神经细胞凋亡，细胞核收缩，染色变深(图.2)。而RAD001能明显减轻这些因长期脑灌注不足导致的在小鼠海马区出现的病理改变和细胞凋亡现象。
　　3、通过免疫荧光法观察到结果：在假手术组中可见海马区中存在大量的ChAT、VAChT、AChE和少量的CD16/32、Iba-1的阳性细胞表达，而在BCAS模型组中VAChT、ChAT的阳性细胞数则显著的减少，CD16/32和Iba-1的阳性细胞数则增加显著，同时可以看到ACHE的荧光强度显著增强，但细胞的数目则减少。RAD001治疗组与BCAS模型组相比， RAD001治疗组的CD16/32和Iba-1的阳性细胞数减少显著，而VAChT、ChAT的表达增加明显，两组相比P<0.05。另一方面，AChE的变化没有统计学的差异（图.4）。
　　4、qRT-PCR结果显示：氧糖剥夺（OGD）后2小时、4小时M1表型(CD16, iNOS, TNF-α)基因及M2表型(IL-10, TGF-β, Arg1)基因的表达达到顶峰（P<0.01），而RAD001治疗后，M1表型(CD16, iNOS, TNF-α)基因的相对表达量下降，M2表型(IL-10, TGF-β, Arg1)基因的相对表达量上升。差异有统计学意义（P<0.01，图.5）。
　　5、蛋白电泳的结果显示：三组中T-Akt无明显差异, RAD001治疗组与模型组比较,P-Akt蛋白量明显增多,三组中T- p70S6k无明显差异,模型组P-p70S6k蛋白量明显增多,而治疗组P-p70S6k的蛋白量显著减少。差异有统计学意义（P<0.05，图6）。
　　结论：RAD001能够通过有效抑制mTORC1途径而减轻因慢性脑灌注不足引起的认知障碍。这些影响源于调节小胶质细胞由M1表型向M2表型的转化。我们的发现认为，RAD001有望作为因颈动脉狭窄而导致痴呆的一种辅助治疗方法。

目录

声明

缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

对象和方法

1．材料和仪器

2．实验方法

3.OGD实验：

4.实时荧光定量PCR（Real-time reverse transcription-quantitative RCR，RT-PCR）

5. 蛋白质印迹分析

6. 统计分析

7.结果

8. 讨论

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:哺乳动物雷帕霉素靶蛋白的研究进展

致谢

个人简历