自体骨髓间充质干细胞复合明胶海绵移植修复羊椎间盘手术缺损

摘要

目的：
　　1、以脱细胞髓核基质和脱细胞软骨基质为原料制备椎间盘髓核支架，行理化检测和生物相容性检测，评估其可行性。
　　2、建立可用于椎间盘缺损修复研究的纤维环部分缺损动物模型。
　　3、比较使用两种不同的方法将自体骨髓间充质干细胞复合明胶海绵移植修复山羊椎间盘手术缺损的效果。
　　方法：
　　1、将髓核和软骨经粉碎、脱细胞、冷冻冻干、联合交联制成支架。对支架行大体观察、理化检测；CCK-8法和Live/Dead染色检测支架毒性和生物相容性。
　　2、使用imageJ1.46r软件测量山羊腰椎X线片上椎间隙高度。轴向剖开椎间盘，测量拟作缺损处纤维环厚度。用11号尖刀在离体和在体山羊椎间盘左前方制作上底3 mm、下底5 mm、高5 mm、厚3 mm的梯形缺损。通过测量纤维环梯形缺损的边长、称量切取的组织来评估纤维环梯形缺损。
　　3、取8只山羊，术前和术后24周行腰椎侧位X线平片和核磁共振成像检查。每只山羊的 L1-2椎间盘作为对照组（A组），不做任何处理；L2-3椎间盘作为单纯摘除组（B组），只摘除部分髓核不进行移植操作；L3-4椎间盘作为富集器组（C组），植入经富集器富集的羊骨髓和明胶海绵复合物；L4-5椎间盘作为自体BMSCs培养组（D组），植入自体BMSCs和明胶海绵复合物。术后24周处死动物，行生物力学、组织学和分子生物学检测。
　　结果：
　　1、大体观察支架呈乳白色、多孔海绵状。电镜扫描和光镜下可见支架呈网状结构，孔隙相互连通。Hochest33258染色可见制成支架呈阴性，脱细胞彻底。HE染色、番红O染色和甲苯胺蓝染色示支架内无细胞残留，蛋白多糖含量丰富。支架的孔径为219.82±46.21μm，孔隙率为95.43%±2.26%，吸水率为1829.14%±273.97%。支架弹性模量为18.43±2.33 Kpa。Live/Dead染色可见支架上细胞生长良好；CCK-8检测结果表明支架浸提液对细胞增殖无不利影响。
　　2、山羊腰椎间隙高度为(4.45±0.28) mm，拟作缺损处纤维环厚度为(4.08±0.50) mm，分别与拟作梯形缺损的厚度3 mm和高度5 mm的差异有统计学意义(P<0.05)；离体纤维环梯形缺损的上底(3.03±0.09) mm、下底(5.03±0.09) mm、高度(4.97±0.10) mm和厚度(3.02±0.06) mm分别与梯形缺损预定值上底3 mm、下底5 mm、高度5 mm和厚度3 mm之间的差异无统计学意义(P﹥0.05)；从离体和在体的纤维环梯形缺损处取出组织重量分别为(0.162±0.011) g和(0.166±0.014) g，两者差异无统计学意义(P﹥0.05)。
　　3、术后动物全部存活，术后24周，A组椎间盘各项检测指标均正常，没有退行性改变，但B、C、D组椎间盘均有不同程度退变表现。影像学检测结果显示相对于B组，术后C、D组DHI%和髓核RGI明显较高(P<0.05),其中D组RGI又比C组高,且差异有统计学意义(P<0.05)；生物力学检测显示C、D组脊柱活动度明显较B组好(P<0.05)，而 C组和D组之间相比无显著差异(P>0.05)；HE染色、番红O染色及天狼星红染色结果显示相对于B组，C、D组髓核内细胞增殖活跃，细胞数量明显较多，组织结构相对较好，髓核内蛋白多糖和胶原含量高。实时定量 PCR检测显示相对于B组，C、D组髓核组织蛋白多糖、Ⅱ型胶原、及 SOX-9基因相对表达量均明显较高(P<0.05)，其中 D组又比 C组高(P<0.05)。
　　结论：
　　1、髓核-软骨细胞外基质支架具有三维多孔、孔径大小均匀、生物相容性好、原料来源广泛、可降解的特点,能够作为构建组织工程髓核的支架。
　　2、通过左侧横突旁腹膜后入路，使用实验中制作缺损的方法可以简单、安全、可靠地制作出形状、大小较为统一的羊纤维环梯形缺损动物模型，有望成为理想的纤维环缺损修复动物模型。
　　3、分别将富集的骨髓和培养的自体 BMSCs复合明胶海绵植入山羊髓核，均能够有效延缓椎间盘退变，促进髓核细胞增殖和细胞外基质的分泌，有利于维持椎间盘高度及生物力学性能。与自体BMSCs培养组相比，虽然富集器组的修复效果较弱，但其操作简单、安全、经济，因此仍具有良好的临床应用前景。

目录

声明

缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、髓核-软骨细胞外基质支架的制备与评估

1.1对象和方法

1.2结果

1.3讨论

1.4小结

二、羊纤维环部分缺损动物模型的构建

2.1对象和方法

2.2结果

2.3讨论

2.4小结

三、自体BMSCs复合明胶海绵移植修复羊椎间盘手术缺损

3.1对象和方法

3.2结果

3.3讨论

3.4小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:椎间盘退行性疾病生物学治疗研究进展

致谢

个人简历