明胶海绵为支架山羊骨髓间充质干细胞复合富血小板血浆移植修复纤维环缺损的实验研究

摘要

目的：　　探讨研究山羊骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cell，BMSCs）的分离培养以及鉴定的方法，同时对山羊BMSCs的生长特性进行研究，为下一步进行体内实验奠定基础。　　方法：　　对BMSCs进行梯度离心，分离出纯化的BMSCs，然后利用贴壁培养的方法，进行培养并且传代，使得细胞进行增殖，运用倒置显微镜对第3、4代BMSCs进行观察。观察细胞的形态和生长情况。最后，使用免疫细胞化学的方法对第3、4代BMSCs的表面标志抗原CD29、CD34和CD44的表达，进行鉴定。　　结果：　　山羊BMSCs在体外培养，成功传代并实现了细胞增殖，而且通过镜下观察到第3、4代细胞增殖迅速，生长旺盛。细胞免疫中显示出实验中BMSCs对 CD29，CD44表达为阳性，对CD34表达为阴性，鉴定确为BMSCs的表达。结论应用梯度离心法提取培养的 BMSCs呈现梭形，纤维状生长，克隆能力强，并且在第3、4代时候活性最强，增殖最快，为下一步体内实验的成功移植提供了良好的种子基础。　　目的：　　研究观察山羊富血小板血浆对山羊骨髓间充质干细胞的影响。　　方法：　　抽取6只6月龄的健康山羊颈静脉血，采用二度离心法获取山羊的富血小板血浆，然后运用骨穿包从山羊髂骨上抽取山羊的骨髓，采用梯度离心的方法分离，纯化获得山羊BMSCs，然后取生长状态较好的原代细胞，在配好的完全培养基中加入体积分数为0.3,0.2,0.1富血小板血浆，与没有加入山羊的富血小板血浆的形成对照组。　　结果：　　①实验组中加入0.1体积分数山羊富血小板血浆的第4 d，山羊BMSCs增殖的活力增高，呈较快生长，生长曲线上升幅度增大，细胞倍增时间约50h。相比较之下，加入0.2体积分数山羊富血小板血浆的第4 d，山羊BMSCs增殖的活力较0.1组增高，而且生长曲线幅度相对较高，细胞倍增时间缩短为35h。而加入0.3体积分数的山羊富血小板血浆的第4d，山羊 BMSCs的生长活力是最高的，生长曲线上升幅度最大，倍增时间是最短的为25h；　　②在山羊BMSCs培养的第4天，分别加入体积分数为0.3，0.2，和0.1自体富血小板血浆的实验组，与对照组比较差异有显著性意义（P<0.05，P<0.01）。　　结论：　　山羊富血小板血浆对于山羊BMSCs的增殖作用确实有明显的帮助，而且体积分数越大的富血小板血浆对于山羊BMSCs的增殖能力越显著。越能显著地促使完全培养基内山羊的BMSCs增殖。　　目的：　　研究以明胶海绵为载体山羊骨髓间充质干细胞复合富血小板血浆移植修复纤维环缺损的组织学特性。　　方法：　　从山羊的髂骨中提取和分离出骨髓间充质干细胞，并将其进行传代培养，培养到第3代时进行细胞鉴定。然后从山羊颈静脉进行抽血，利用二度离心的方法制成富血小板血浆。在动物实验中，将山羊的椎间盘按要求分为三组：空白对照组、对照组、和实验组。空白对照组是对椎间盘不进行任何干预。对照组是利用手术器械对纤维环造成1×1cm的缺损，然后逐层缝合切口。实验组则是先将骨髓间充质干细胞加入PBS，制成细胞悬液。在无菌的环境下将明胶海绵处理成1×1cm的小正方体，将制备好的细胞悬液打入明胶海绵中。然后对山羊进行人工破损纤维环手术：首先在手术中清理软组织，找到两横突之间白色的类似软骨的组织，此为纤维环。用尖刀破损一个1×1cm的缺口，将复含山羊BMSCs的明胶海绵放入破损中，在海绵上层覆盖一层胶冻状的富血小板血浆，然后逐层进行缝合。在手术后的的3周、6周、12周三个时间段按照三个不同的分组分别取出破损后生长的组织，然后进行HE染色、Masson三色明胶染色、AB-PAS染色、和Ⅱ型胶原的检测。最后，对各种方法的不同组进行对比分析。　　结果：　　成功的分离培养出第3代骨髓间充质干细胞，细胞生长稳定，增殖迅速，形态成梭形。以明胶海绵为载体山羊骨髓间充质干细胞复合富血小板血浆成功修复了纤维环的缺损，防止了髓核的突出。在HE染色中，根据时间的分组，显示出组织中各种修复细胞数目逐渐增多，细胞越成熟，修复能力越强。在Masson三色明胶染色中，观察到很多成纤维细胞或者组织正在进行修复，随着时间的推移，纤维组织越来越多，成纤维细胞越来越增多。而在AB-PAS染色中可以看到纤维环修复的过程中，有软骨细胞修复的参与。而且通过对Ⅱ型胶原免疫组化的检测，显示出Ⅱ胶原的含量是逐渐增高的。　　结论：　　通过分组对比，证实了山羊骨髓间充质干细胞对纤维环缺损有更好的修复能力，随着时间的延长，各种组织或者细胞的数目增多，大体的组织形态也逐渐接近于空白对照组，说明其修复程度是越来越高的。为下一步进行临床实验的研究奠定了坚实的实验基础。

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第一部分 密度梯度离心法分离培养山羊骨髓间充质干细胞的形态学观察及鉴定

前 言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

5 附图表

6 参考文献

第二部分 山羊富血小板血浆的制备以及它对山羊骨髓间充质干细胞的作用的实验研究

前 言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

5 附图表

6 参考文献

第三部分 明胶海绵为载体骨髓间充质干细胞复合富血小板血浆移植修复纤维环缺损的组织学观察

前 言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

5 附图表

6 参考文献:

文献综述:纤维环再生与修复方法的研究进展

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