MANF对视网膜光感受器细胞和神经节细胞的保护作用

摘要

视网膜色素变性（Retinitis pigmentosa, RP）是基因缺陷导致的视网膜进行性营养不良性退行病变。其病理损害包括光感受器细胞进行性凋亡及色素上皮细胞的变性，最终引起夜盲、进行性视野缩小、视力下降，终致失明。据统计，目前全世界每3000-5000人中即有一位是视网膜色素变性患者，国内约有超过40万的视网膜变性患者。RP晚期患者视力低下，生活质量差，给社会和家人带来沉重的负担。从理论上来讲，基因治疗是治疗RP最理想的手段，但目前研究却未取得重大突破。究其原因，一方面与RP患者具有遗传异质性及多效性，难以找到针对RP基因治疗的切入点有关。另一方面，基因治疗的有效性和安全性还有待进一步完善。所以从严格意义上来讲，目前RP仍无切实有效的治疗手段。近年来，治疗方面研究的重点逐渐转向通过药物（包括神经营养因子）治疗，试图减缓光感受器细胞变性的速度，使患者维持更久的有用视力。RP的病理机制研究发现内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS)的关键蛋白参与调控视网膜色素上皮细胞的凋亡及光感受器细胞的损伤，但某些关键蛋白（如Transcriptional factor C/EBP homologous protein，CHOP）的作用到底是促进凋亡还是减轻损伤，却存在争论。
　　视网膜缺血再灌注（Retinal ischemia-reperfusion，RIR）的病理过程和许多眼科疾病相关，如青光眼、糖尿病视网膜病变、视网膜和脉络膜血管阻塞性疾病等。目前已知，造成视网膜病理损伤的主要因素是在多种因素的作用下，再灌注的血流对组织细胞造成的一系列损伤,导致视网膜内层（主要包括：内核层、内丛状层及神经节细胞层）变薄，神经节细胞(Retinal ganglion cell, RGC)数量减少和凋亡，视功能下降，如无有效的治疗终致失明。RIR损伤的病理机制与多种因素有关，目前认为内质网应激对RIR引起的神经节细胞凋亡起着重要作用，但具体作用机制尚不明确。
　　MANF（mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor，又名 ARMET（argi-ninerich, mutatedinearlystageoftumors)是一类新型的神经营养因子，2003年由Petrova等人首次在体外传代的大鼠中脑Ⅰ型星形胶质细胞的培养基中分离而来，哺乳动物的MANF广泛存在于中枢神经系统。实验证实MANF能促进体外多巴胺神经元存活，特异性地减轻多巴胺类神经元细胞的损伤。我们的前期研究也发现，MANF能延缓S334-3转基因大鼠光感受器细胞的退行性变。那么， MANF能否也对视网膜神经节细胞产生类似的保护作用？本研究拟运用基因干扰，免疫组化等方法，观察MANF预处理后RIR过程中RGC凋亡的情况，探讨MANF能否对RIR后RGC的凋亡产生保护作用。众所周知，MANF在细胞外有神经营养因子活性，在细胞内作为一种内质网应激反应蛋白，参与ERS反应保护细胞。因此，我们拟通过检测MANF对S334-3转基因大鼠ERS相关蛋白表达的影响，寻找MANF经ERS途径保护视网膜光感受细胞凋亡的分子机制及信号通路。为研究MANF对视网膜光感受器细胞和神经节细胞保护作用提供理论依据，寻找MANF保护视网膜作用的分子信号通路和作用靶点，研发新的治疗药物和手段。
　　第一部分 MANF对视网膜光感受器细胞保护作用的机制和分子信号通路
　　目的
　　观察MANF对S334-3视紫红质突变转基因大鼠视网膜的光感受器细胞（Retinal photoreceptor cells）的保护作用，通过检测ERS相关蛋白的表达，研究MANF保护视网膜光感受器细胞的作用机制和相关的分子信号通路。
　　方法
　　应用环氧树脂视网膜组织超薄切片技术，观察玻璃体腔内注入MANF(5μg／2μl)后，S334-3大鼠视网膜组织病理变化。检测不同日龄（PD6、PD8、PD10、PD12、PD14、PD16、PD18、PD20）S334-3大鼠ERS的标记蛋白（CHOP，ATF6， IRE1α，BIP，PERK），观察ERS相关蛋白含量随RP病程进展的变化规律。分别给S334-3大鼠和正常SD大鼠右眼注入MANF(5μg／2μl)，左眼注入2μl PBS做对照组，Western Blotting检测注入MANF后不同时间点（6h，12h，24h，48h，72h）ERS相关蛋白（CHOP，ATF6，IRE1α，BIP，PERK）的表达及蛋白含量变化的规律。
　　结果
　　玻璃体腔内注射MANF能延缓S334ter-3大鼠视网膜外核层（Outer Nuclear Layer, ONL)萎缩变薄，改善细胞形态，减少细胞凋亡，而其他细胞层变化不明显。PD10-20的S334-3大鼠在RP快速进展期间，未检测到ERS相关蛋白（BiP, IRE1α, PERK, ATF6, CHOP）表达。在S334-3大鼠玻璃体腔内注射MANF6小时后，即可检测到ATF6和 CHOP的表达出现急剧地升高，CHOP含量12小时达峰值，随后开始下降，浓度升高一直持续到48小时。ATF6的含量在注射后6小时最高，随后迅速下降，12小时后即降至正常。CHOP含量升高持续的时间较ATF6长。SD大鼠玻璃体腔内注射MANF6小时后，ATF6和 CHOP的表达呈现一致性上升，CHOP含量逐渐上升，ATF6含量在注射后12h稍下降，随后再次升高，二者的含量均在24h后达峰值（和对照组相比，差异均有统计学意义）。而二类大鼠视网膜组织中IRE1α、BIP、PERK蛋白含量在各时间点均无任何变化（差异均无统计学意义）。
　　结论
　　MANF可抑制S334-3大鼠视网膜感光细胞的凋亡，延缓RP的病程。ERS未直接参与S334-3大鼠RP快速进展的病程。外源性的MANF可能通过激活ATF6途径，上调CHOP的表达，诱发ERS启动对S334-3大鼠光感受器细胞的保护作用。
　　第二部分 MANF对视网膜缺血再灌注损伤造成的视网膜神经节细胞凋亡的作用
　　目的
　　通过观察玻璃体腔内注射MANF预处理后再行RIR，检测C57BL/6J小鼠视网膜神经节细胞凋亡的情况，研究MANF对RIR造成的RGC凋亡的作用。
　　方法
　　应用基因转染技术将MANF基因转染至细胞系，构建转染MANF的腺病毒载体（AAV-MANF）。给C57BL/6J小鼠玻璃体腔注射AAV-MANF，通过RT-PCR、Western blot和免疫荧光染色技术，验证MANF能否在视网膜组织中持续稳定地表达。给C57BL/6J小鼠分别做如下预处理RIR（MANF注射组、PBS注射组、干针假注射组和不处理组），次日制作RIR模型，1周后采用NeuN免疫组化染色观察各组 RIR后 RGC凋亡的情况。给 C57BL/6J小鼠做如下预处理（AAV-MANF组、AAV-GFP组和不处理组），次日制作RIR模型，3周后采用NeuN免疫组化染色观察各组RIR后RGC凋亡情况，通过Image J图片分析软件计算各组RGC存活率，比较存活率的差异。采用Western blot、免疫组化染色等技术，检测MANF在视网膜组织中的定位表达。
　　结果
　　基因转染技术构建AAV-MANF成功，Western blot和免疫组化结果证实玻璃体腔内注射AAV-MANF后，MANF能在视网膜组织中持续稳定地表达。玻璃体腔内注射MANF能抑制RIR后RGC的凋亡，但效果并不显著，RGC存活率仅32%，和注射PBS组（27%）相比，细胞存活率组间的差异无统计学意义（P>0.05）。而干针组（假注射组）RGC的存活率（44%）甚至比MANF组的存活率（32%）高，且两组之间差异有统计学意义（P=0.036，<0.05）。注射AAV-MANF组RGC存活率达78%，和其他两组（AAV-GFP组21%和不处理组25%）相比，RGC存活率显著增高，差异具有统计学意义（P值均=0）。免疫组化染色结果显示：玻璃体腔注射AAV-MANF后，MANF主要在Muller细胞（包括细胞体部，纤维突及终足）及神经节细胞中的表达。
　　结论
　　MANF对RIR类疾病进程中RGC的凋亡具有保护作用。MANF有望成为预防和治疗RIR类疾病中RGC凋亡的新选择，而通过玻璃体腔内注射基因转染技术构建的AAV-MANF是一种有效的给药方式。

目录

声明

缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、MANF对视网膜光感受器细胞保护作用的机制和分子信号通路

1.1对象和方法

1.2结果

1.3讨论

1.4小结

二、MANF对视网膜缺血再灌注损伤造成的视网膜神经节细胞凋亡的作用

2.1对象和方法

2.2结果

2.3讨论

2.4小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:内质网应激介导视网膜缺血再灌注损伤致神经节细胞凋亡的研究进展

致谢

个人简历