一种诱导人iPSc源性的3D视网膜定向分化为视网膜神经节细胞的方法

摘要

本发明公开了一种诱导人iPSc源性的3D视网膜定向分化为视网膜神经节细胞的方法。它是将人iPSc源性的3D视网膜的神经纤维层消化为单细胞，以该单细胞作为种子细胞接入诱导分化培养基中进行培养，种子细胞分化成视网膜神经节细胞，所述的诱导分化培养基为含有神经营养因子和维持浓度的视网膜分化营养液组成的培养基。本发明从干细胞诱导分化的角度提供了获得一种功能性RGCs新的研究途径，为人iPSc-RGCs的定向分化提供了一种新的研究思路，为探讨人iPSc-RGCs的调控机制提供了新的研究线索，为神经组织工程的研究提供了一种新的种子细胞，并为干细胞移植治疗视觉损伤奠定了理论和实验基础。

说明书

技术领域：

本发明属于发育生物学和生物医学工程领域，具体涉及一种诱导人iPSc源性的3D视网 膜定向分化为视网膜神经节细胞的方法。

背景技术：

视网膜神经元的损伤和修复是神经性视觉损伤发生、发展和转归共同的科学问题。近年 随着干细胞研究的迅速发展，诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcells,iPSCs)为视觉神经 损伤的修复与治疗带来了新的希望。由于iPSCs自我复制和多分化潜能，作为修复神经系统 损伤的供体不但能满足移植时所需的细胞量，而且iPSCs在一定条件下能诱导分化为包括神 经元在内的不同的神经细胞系。因此，将人源性的iPSCs通过移植治疗视觉神经损伤并恢复 机体功能，具有重要的理论意义和良好的临床治疗前景。研究发现将iPS细胞直接移植到受 损的视网膜组织后，90％以上的细胞均分化为星形胶质细胞，几乎没有神经元的存在。而神 经元对损伤后视功能的恢复起着决定性的作用。因此，能否在体外将iPS细胞定向诱导分化 为特定的视网膜神经元就成为制约其临床应用的关键问题之一。

众多的研究表明，睫状神经营养因子(CNTF)可特异性地促进iPS分化成为星形胶质细胞； 脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、神经营养素-3(NT-3)、胶质源性神经营 养因子(NF)、视黄酸等均可促进iPS向神经元方向分化。NT4、BDNF可保护中枢神经元免 受兴奋性神经递质的损害，神经营养因子通过稳定细胞膜内钙离子的水平而保护神经元免受 兴奋性神经递质的损害，N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)可诱导BDNF的表达。BDNF、NGF、 GDNF对体外压力作用下的视网膜神经细胞具有保护作用。总之，目前化学因素对iPS定向 分化诱导的神经元主要为运动神经元和多巴胺能神经元。而将人iPSCs源性3D视网膜利用 化学因子将其特异分化为RGCs的研究还未见明确的报道。由于RGC是视网膜重要组成部分， 将人iPSCs源性3D视网膜定向分化为功能性RGCs无论对干细胞与再生医学的基础研究还是 眼科学临床治疗都具有重要的理论和实际应用价值。

发育生物学研究表明，无论是低等还是高等的动物，其视觉系统的发育和可塑性变化均 需要精确的时间和空间的调控，从视泡、视杯发育到神经视网膜、视网膜色素上皮的分化进 一步发育分化成为精细的视网膜结构。因此认为RGCs的发育与成熟除了化学因素影响外， 精细的时空调控也是必不可少的重要诱导条件。由于RGCs在视觉信号的传入、视觉信息的 传导完整以及视功能维持等方面均具有重要的作用，其损伤后较难以通过其它方式进行替代。 因此，视觉神经损伤后恢复RGCs的数目和功能不仅有助于减缓视神经损伤病人病情的恶化， 促进患者视觉功能的恢复，也必将促进损伤视神经结构和功能的重建，对整个神经系统的损 伤修复以及神经组织工程学的研究也会产生积极的推动作用。

发明内容：

为了克服现有种子细胞来源诱导功能低下的问题，本发明提供一种体外诱导人iPSc源性 的3D视网膜定向分化为视网膜神经节细胞(RGCs)的方法。

本发明的诱导人iPSc源性的3D视网膜定向分化为视网膜神经节细胞的方法，包括以下 步骤：将人iPSc源性的3D视网膜的神经纤维层消化为单细胞，以该单细胞作为种子细胞接 入诱导分化培养基中进行培养，种子细胞分化成视网膜神经节细胞，所述的诱导分化培养基 为含有神经营养因子(bFGF、CNTF、BDNF)和维持浓度的视网膜分化营养液(RDM)组成的培养 基。

所述的诱导分化培养基优选为：每ml含有bFGF10ng、BDNF20ng、CNTF20ng、N2 supplement1ng、非必须氨基酸(essentialmedia-nonessentialaminoacidsNEAAs)1ng、肝素 2μg，余量为DMEM/F12培养基，所述的DMEM/F12培养基是由DMEM培养基和F12培养 基按照体积比1：1混合而成。

bFGF为碱性成纤维细胞生长因子，BDNF为脑源性神经营养因子，CNTF为亲胆碱能神 经元因子，N2supplement为N2添加剂，essentialmedia-nonessentialaminoacids(NEAAs)为 非必须氨基酸，heparin为肝素，它们都是现有技术中的物质。

所述的将人iPSc源性的3D视网膜的神经纤维层消化为单细胞优选为将人iPSc源性的3D 视网膜的神经纤维层放入D-Hanks液中，分离组织，离弃视网膜组织中色素沉着部分，保留 金黄色的组织部分的神经纤维层，将分离的神经纤维层组织用PBS冲洗，吸除PBS后用 accutase细胞消化液消化细胞团成单细胞后加入诱导分化培养基终止消化，混悬液离心去上清 后，得到种子细胞。

所述的培养优选是在37℃、5％C02，饱和湿度下进行培养。

本发明人团队前期已成功将人源性的iPSc细胞诱导分化为人iPSc源性的3D视网膜 (XiufengZhong,etal.Generationofthree-dimensionalretinaltissuewithfunctional photoreceptorsfromhumaniPSCs,NatCommun.2014Jun10；5:4047)。本发明中首先将该人iPSc 源性的3D视网膜组织神经纤维层机械分离消化为单细胞，以其作为种子细胞接种于含特定 神经营养因子(bFGF、CNTF、BDNF)的无血清培养环境中，通过时间调控和化学因子共同作 用，将种子细胞定向诱导分化为功能性的视网膜神经节细胞(RGCs)。本发明不仅对视神经 损伤的救治与功能康复有重要的理论和实际意义，而且对整个神经系统组织工程中种子细胞 的研究也有积极的推动作用。

本发明从干细胞诱导分化的角度提供了获得一种功能性RGCs新的研究途径，为人 iPSc-RGCs的定向分化提供了一种新的研究思路，为探讨人iPSc-RGCs的调控机制提供了新 的研究线索，为神经组织工程的研究提供了一种新的种子细胞，并为干细胞移植治疗视觉损 伤奠定了理论和实验基础。

附图说明：

图1是不同时间诱导分化下RGC细胞轴突的生长情况，分化的RGCs轴突随时间变化而增长， 其培养7天轴突长度为169.02-322.05μm(A)，14天后轴突长度为170.35-369.21μm(B)，21天 轴突长度为269.28-508.87μm(C)；

图2是RGC细胞生长14天后的细胞抗体Brn3b(A),Tubulin(B)及Nestin(C)免疫荧光 染色；

图3是视网膜神经节细胞(RGC)细胞生长21天后细胞轴突蛋白(NFH)免疫荧光染色；

图4是RGC细胞生长21天后细胞钠离子通道蛋白(Nav1.6)免疫荧光染色

图5是应用膜片钳技术检测RGC细胞的动作电位结果，其中A为RGC细胞动作电位，B为 使用河豚毒素干扰RGC细胞后动作电位下降，洗脱毒素后动作电位恢复。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

一、人iPSc源性的3D视网膜分离消化：

采用机械分离的办法，将培养50-55天的人iPSc源性的3D视网膜(具体制备方法参考 文献：XiufengZhong,etal.Generationofthree-dimensionalretinaltissuewithfunctional photoreceptorsfromhumaniPSCs,NatCommun.2014Jun10；5:4047)的神经纤维层放入 D-Hanks液中，于50倍正置显微镜下使用0.45mm针头分离组织，离弃视网膜组织中色素沉 着部分(色素层)，保留金黄色的组织部分(神经纤维层)；将分离的神经纤维层组织使用移液 管转移至3.5cm培养皿，使用PBS冲洗10分钟；吸除PBS后用accutase细胞消化液消化细 胞，置于37℃培养箱中30min；过程后期可将细胞吸入离心管吹打，在10倍正置显微镜下见 细胞团被消化成单细胞后加入2ml诱导分化培养基终止消化。将混悬液离心(1000转/5min)后 吸出上清，得到种子细胞(沉淀)，然后在种子细胞中加入诱导分化培养基吹打混匀，将该含 有种子细胞的诱导分化培养基分别移入预先经基质胶Matrigel包被的培养皿中(种植密度： 1×10⁵个/cm²)，37℃、5％CO₂饱和湿度下进行原代培养，种子细胞就定向分化为视网膜神经 节细胞(RGCs)。

所述的诱导分化培养基为：每ml含有bFGF10ng、BDNF20ng、CNTF20ng、N2supplement 1ng、非必须氨基酸(essentialmedia-nonessentialaminoacidsNEAAs)1ng、肝素2μg，余量 为DMEM/F12培养基，所述的DMEM/F12培养基是由DMEM培养基和F12培养基按照体积 比1：1混合而成。其配制方法为：将DMEM培养基和F12培养基按照体积比1：1混合形 成DMEM/F12培养基，然后按照上述成份的含量，在DMEM/F12培养基中添加bFGF、BDNF、 CNTF、N2supplement、非必须氨基酸和肝素，混合均匀而得诱导分化培养基。

二、RGC的鉴定

(1)形态学鉴定：取步骤一中原代培养分化的培养细胞用4％多聚甲醛固定15分钟，0.01％ 的PBS洗3次后，0.1％TritonX-100孵育15分钟，3％驴血清封闭30min后，分别加入一定 比例稀释后的羊抗大鼠Brn3b(santacruz)，小鼠抗大鼠β-Tublin(abcom)及兔抗大鼠Nestin (abcom)；大鼠抗人NFH(Proteintech)；兔抗大鼠Nav_1.6(Almon)孵育24小时，并加入相应 的荧光二抗进行免疫荧光双标染色。

(2)功能鉴定：将步骤一中原代培养分化后的细胞用溶液(Sigma，含140mM氯化钠液,5 mM氯化钾液,1.5mM氯化钙液,1mM硫酸镁液,10mM葡萄糖液及10mM谷氨酸液，pH 7.0)洗净。通过电极拉制仪(PULL-100，美国)拉制电极，选择膜表面光滑清晰的RGC细胞， 利用三维操纵器移动电极贴近目标细胞，并轻压在细胞表面，稍加负压即可形成1GΩ水平 以上的高阻抗封接，再用较大负压吸破细胞膜，形成普通的全细胞记录形式。在电极内液中 充入两性霉素B(0.2-0.3g/L-1,sigma),几分钟内可见系统阻抗逐渐降低，至100MΩ形成稳定 穿孔。在60倍正置显微镜(BX50WI,olympus)下观察。实验过程由刺激采集软件Multiclamp 700Bamplifier控制，经膜片钳放大器(EPC10，德国)通过模数转换采集数据。使用pCLAMP 10.2版本软件对数据进行分析。

三、结果

种子细胞在诱导分化培养基中培养一天后，细胞发生贴壁。在培养7天后可见较小胞体 的种子细胞周围出现较长突起，形态上类似神经元细胞。14天后分化细胞数量增多，突起明 显增长，21天后分化细胞互相连成网状(见图1，图中A.培养7天后RGC细胞的分化；B.培 养14天后RGC细胞的分化；C.培养21天后RGC细胞的分化)，经应用Brn3b、β-Tublin及 Nestin免疫双标染色后发现，在诱导细胞中可表达RGC细胞的特异性染色，说明该类型的分 化细胞为RGC细胞(结果见图2)；视网膜神经节细胞(RGC)细胞生长21天后细胞轴突蛋 白(NFH)免疫荧光染色阳性，说明诱导RGC细胞轴突发育成熟(图3)；RGC细胞生长21 天后细胞钠离子通道蛋白(Nav1.6)免疫荧光染色阳性，说明诱导的RGC细胞具有Na离子 通道(图4)；同时通过膜片钳进行刺激后，可观察到RGCs细胞内动作电位明显增高 (-50mV--20mv)，表明分化的RGCs具有基本的电生理活动(结果见图5)，说明通过时间调控 和特定化学分子联合作用可将人iPSc源性的3D视网膜的神经纤维层的种子细胞诱导分化为 具有功能的RGCs细胞。