自身免疫性溶血性贫血患者miR-150,Th17数量和T细胞CD69临床意义的研究

摘要

自身免疫性溶血性贫血（Autoimmune Hemolytic Anemia，AIHA）/Evans综合征是一类以血液中出现抗红细胞自身抗体和/或血小板抗体，破坏红细胞而产生溶血性贫血为特征的自身免疫性疾病。作为产生和分泌自身抗体的免疫细胞， B淋巴细胞在AIHA/Evans综合征的发病过程中发挥着重要的作用[1]，研究B淋巴细胞数量的调控因素有利于深入了解AIHA/Evans综合征的免疫发病机制[2]。随着 microRNA（miRNA）芯片及生物信息学发展，研究显示成熟 B淋巴细胞中miR-150表达明显增高[3]，且调控B淋巴细胞，因而检测了AIHA/Evans综合征中B淋巴细胞中miR-150与其靶基因c-Myb的表达情况。
　　自身免疫性疾病中 T淋巴细胞对 B淋巴细胞有重要的辅助作用，尤其是调节性T细胞，Th17是一类重要的调节性T细胞，了解Th17在AIHA中的变化规律对于了解AIHA/Evans综合征的发病机制有重要的意义。用流式细胞仪检测了AIHA/Evans综合征的患者Th17细胞的数量变化；CD69分子与Gelectin-1共同调控Th17细胞，因此检测了AIHA/Evans综合征患者T淋巴细胞亚群及早期活化指标CD69。
　　第一部分miR-150通过c-Myb调控AIHA/Evans综合征患者B淋巴细胞的功能
　　目的：
　　了解AIHA/Evans综合征患者B淋巴细胞的数量及调控因素。
　　方法：
　　选取溶血发作患者18例，缓解组患者17例，健康对照15名，慢性淋巴细胞白血病（Chronic Lymphoblatic Leukemia，CLL）患者6例，流式细胞仪检测外周血CD19+B细胞数量；用免疫磁珠分选法分选外周血CD19+B淋巴细胞；RT-PCR方法检测c-Myb和miR-150的相对表达量；进行c-Myb和miR-150的相关性分析及c-Myb和miR-150分别与临床指标的相关性分析。
　　结果：
　　1、溶血发作组CD19+细胞百分比显著高于缓解组和健康对照组（P＜0.05），缓解组和健康对照组无显著差异。CLL组CD19+B细胞百分比(70.42±20.15)%明显高于AIHA/Evans综合征患者溶血发作组(19.35±16.20)%、缓解组(6.58±4.43)%和健康对照组(6.69±2.12)%（P＜0.01）。溶血发作组 CD19+细胞绝对数量显著高于缓解组和健康对照组（P＜0.05）。缓解组和健康对照组无显著差异。CLL组CD19+B细胞绝对数量(1503.40±1184.78)×107/L明显高于AIHA/Evans综合征患者溶血发作组(29.73±19.92)×107/L、缓解组(10.96±7.98)×107/L和健康对照组(9.92±4.03)×107/L（P＜0.01）
　　2、溶血发作组 CD19+细胞 c-Myb mRNA表达(17.65±14.91)高于缓解组(9.23±8.22)（P＜0.05）、健康对照组(3.93±6.37)（P＜0.01）和CLL组(7.36±5.16)（P＜0.05），缓解组、健康对照和CLL组间差异无显著性。
　　3、溶血发作组c-Myb mRNA与血红蛋白（Hb）、补体（C3）呈负相关（P＜0.05），与总胆红素（TBIL）、间接胆红素（IBIL）呈正相关（P＜0.05）。
　　4、溶血发作组CD19+细胞内miR-150表达（0.36±0.49）低于健康对照(1.24±0.73)（P＜0.01）、缓解组(0.76±0.73)（P＜0.05）及CLL组(1.79±1.30)（P＜0.01）。
　　5、溶血发作组miR-150与总胆红素（TBIL）、间接胆红素（IBIL）呈负相关（P＜0.05），与Hb、C3呈正相关（P＜0.05）。
　　6、溶血发作组 c-Myb与 miR-150表达呈负相关（P=0.01）；缓解组 c-Myb与miR-150表达呈负相关（P＜0.05）。
　　结论：
　　AIHA/Evans综合征患者外周血B淋巴细胞数量增多；miR-150表达下降，靶基因c-Myb上调，可能是B淋巴细胞数量增高的原因。
　　第二部分 AIHA/Evans患者Th17细胞的表达
　　目的：
　　检测AIHA/Evans综合征患者外周血Th17细胞的表达情况。
　　方法：
　　分别选取溶血发作患者14例，缓解组患者10例，健康对照10名，采用流式细胞术检测外周血Th17细胞占CD3+CD4+细胞百分比及Th17细胞占总T细胞百分比。
　　结果：
　　1、溶血发作组患者 CD3+CD4+IL-17+/CD3+CD4+比例[（3.34±1.90）%]明显高于缓解组[（1.59±0.70）%, P=0.006]和健康对照者[（1.58±0.99）%, P＜0.01]。
　　2、溶血发作组患者CD3+CD4+IL-17+/T淋巴细胞比例[（1.66±1.04）%]明显高于缓解组[（0.97±0.50）%, P=0.045]和健康对照者[（0.87±0.48）%, P=0.025]。
　　结论：
　　Th17细胞的活化可能参与AIHA/Evans综合征的发病。
　　第三部分AIHA/Evans患者T淋巴细胞上CD69分子的表达
　　目的：
　　检测AIHA/Evans综合征患者外周血T细胞数量及其表面活化分子CD69的表达；CD69与临床指标的相关性分析。
　　方法：
　　分别选取溶血发作患者15例，缓解组患者17例，健康对照13名，采用流式细胞术测外周血CD3+CD4+CD69+、CD3+CD8+CD69+、CD3+CD69+等细胞比例；免疫磁珠分选CD4+T淋巴细胞；RT-PCR法检测CD69的相对表达；ELISA法检测血浆中CD69含量。
　　结果：
　　1、CD3+CD4+/CD3+、CD3+CD8+/CD3+T淋巴细胞比例在三组间无显著差异。溶血发作组 CD4+/CD8+比值(1.33±0.73)明显高于健康对照组 CD4+/CD8+比值(0.88±0.32，P＜0.05)，有统计学意义。
　　2、溶血发作组CD3+CD69+/CD3+T细胞比例[(3.08±1.48)%]明显高于健康对照组[(1.28±0.83)%，P＜0.01]和缓解组[(1.96±1.33)%，P＜0.05]；缓解组患者与健康对照间无显著差异。溶血发作组 CD3+CD69+/CD3+T淋巴细胞绝对值[(2.94±1.81)×107/L]明显高于健康对照组[(1.48±1.42)×107/L，P＜0.05]，与缓解组[(2.43±1.66)×107/L]比较无统计学差异。
　　3、溶血发作组 CD3+CD4+CD69+/CD3+CD4+比例[(2.16±1.56)%]高于缓解组[(1.16±0.62)%， P＜0.05]和健康对照组[(0.94±0.78)%， P＜0.05]。溶血发作组CD3+CD4+CD69+T淋巴细胞绝对值[(1.04±0.98)×107/L]明显高于健康对照组[(0.44±0.38)×107/L，P＜0.05]，与缓解组[(0.58±0.34)×107/L]比较无统计学差异。
　　4、溶血发作组 CD3+CD8+CD69+/CD3+CD8+比例[(4.87±2.56)%]高于健康对照组[(1.83±1.27)%，P＜0.01]；CD3+CD8+CD69+/CD3+CD8+比例在溶血发作组和缓解组间，缓解组与健康组间差异不显著。
　　5、溶血发作组CD3+CD4+CD69+/CD3+CD4+T淋巴细胞比例与Hb呈负相关（P<0.01），与TBIL、IBIL呈正相关（P＜0.01），与Ret%呈正相关（P=0.01）。缓解组CD3+CD4+CD69+/CD3+CD4+T淋巴细胞比例与Hb呈负相关（P＜0.05），与Ret绝对计数、LDH、TBIL、IBIL、C3、C4无关。
　　6、溶血发作组CD4+T淋巴细胞内CD69 mRNA表达量(32.26±35.11)高于缓解组(6.05±5.87)（P＜0.05）及健康对照组(1.76±1.85)（P＜0.01），缓解组CD4+T淋巴细胞内CD69 mRNA表达(6.05±5.87)高于健康对照组(1.76±1.85)（P＜0.05）。
　　7、溶血发作组AIHA/Evans患者血浆CD69水平[(494.21±16.06)pg/ml]高于健康对照组[(441.39±104.6)pg/ml，P＜0.05]。
　　结论：
　　AIHA/Evans患者存在T淋巴细胞数量增多，功能亢进。T淋巴细胞处于活化状态，其活化标志CD69表达增高。

目录

声明

缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、miR-150通过c-Myb调控AIHA/Evans综合征患者B淋巴细胞

1.1对象和方法

1.2结果

1.3讨论

1.4小结

二、AIHA/Evans综合征患者Th17细胞的表达

2.1对象和方法

2．2结果

2．3讨论

2．4小结

三、 AIHA/Evans综合征患者T细胞上CD69的表达

3.1对象和方法

3．2结果

3.3讨论

3.4小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:miR-150与造血调控

致谢