钙信号和短链脂肪酸调节糖代谢机制研究

摘要

目的： 骨骼肌和肝脏是葡萄糖代谢的主要外周组织，对维持机体血糖稳态具有重要作用。代谢异常可导致炎症以及胰岛素抵抗，长期的炎症和胰岛素抵抗相互作用可诱发2型糖尿病，其机制涉及传统的胰岛素靶组织以及免疫细胞和血管内皮。胰岛素和运动/肌肉收缩是两种调节血糖的生理性作用，胰岛素抵抗时胰岛素促进的胰岛靶组织如骨骼肌摄取葡萄糖能力下降，而运动/肌肉收缩促进的骨骼肌摄取葡萄糖作用不受影响，相比于胰岛素，运动/肌肉收缩促进的骨骼肌葡萄糖摄取的机制尚不明确。此外，肠道菌群酵解食物中的膳食纤维和抗性淀粉等产生的短链脂肪酸具有降低体重和增加胰岛素敏感性及抗炎的作用，但其对胰岛素靶组织以及内皮细胞的具体作用机制尚不明确。本研究探讨肌肉收缩升高胞浆钙离子浓度调节骨骼肌摄取葡萄糖的分子机制，以及短链脂肪酸对骨骼肌、肝脏、内皮细胞糖代谢和炎症的影响。 方法： 第一部分，应用稳定过表达GLUT4myc的L6-GLUT4myc、过表达AS160的L6-GLUT4myc-AS160WT、过表达AS1604A（四个位点突变而不能被磷酸化）的L6-GLUT4myc-AS1604A大鼠骨骼肌细胞，探讨钙信号调节骨骼肌细胞葡萄糖摄取的分子机制。应用RNA干扰技术分别下调L6-GLUT4myc细胞PKCδ、PKCδ和PKCε、PKCα、PKCθ、Rab10、Rab13蛋白表达，1μM钙离子载体ionomycin孵育细胞10分钟，ELISA检测细胞表面GLUT4myc、GLUT4myc内吞和外排，Western blot检测PKCε、PKCδ、PKCα、PKCθ、Rab10、Rab13、GLUT4、AS160蛋白表达，以及AS160、TBC1D1、AMPK、CaMKⅡ的磷酸化水平。 第二部分，探讨短链脂肪酸对骨骼肌代谢和炎症的影响。分别应用不同浓度的乙酸钠、丙酸钠和丁酸钠孵育L6-GLUT4myc大鼠骨骼肌细胞24小时，ELISA检测细胞表面GLUT4myc水平，Western blot检测GLUT4蛋白表达以及AMPK、ACC的磷酸化水平。应用棕榈酸与乙酸钠、丙酸钠和丁酸钠共孵育细胞24小时，Western blot检测NF-κB、JNK的磷酸化水平和SOCS3蛋白表达。 第三部分，探讨短链脂肪酸对肝细胞代谢的影响。分别应用不同浓度的乙酸钠、丙酸钠和丁酸钠孵育AML12小鼠肝细胞24小时，Western blot检测AMPK、ACC、GSK-3β的磷酸化水平。 第四部分，探讨丙酸对内皮细胞炎症分子的影响。应用棕榈酸与丙酸钠共孵育HUVEC人脐静脉内皮细胞24小时，Western blot检测AMPK、NF-κB、JNK的磷酸化水平。 结果： 第一部分结果显示，骨骼肌细胞中，siPKCδ不影响ionomycin促进的GLUT4myc转位，siPKCα和siPKCθ可分别抑制ionomycin促进的AS160和TBC1D1的磷酸化，AS1604A抑制ionomycin促进的GLUT4myc转位，siRab10不影响ionomycin促进的GLUT4myc转位，siRab13抑制ionomycin促进的GLUT4myc外排。 第二部分结果显示，乙酸钠、丙酸钠和丁酸钠可增加骨骼肌细胞表面GLUT4myc水平和GLUT4蛋白表达，促进AMPK和ACC磷酸化，抑制棕榈酸诱导的JNK的磷酸化，并且丙酸钠和丁酸钠可抑制棕榈酸诱导的NF-κB的磷酸化，丙酸钠可抑制棕榈酸诱导的SOCS3蛋白表达。 第三部分结果显示，乙酸钠、丙酸钠和丁酸钠可促进小鼠肝细胞AMPK、ACC的磷酸化，丁酸钠可促进GSK-3β的磷酸化，而乙酸钠和丙酸钠不影响GSK-3β的磷酸化。 第四部分结果显示，在内皮细胞中，丙酸钠可磷酸化AMPK，抑制棕榈酸诱导的NF-κB和JNK的磷酸化。 结论： 1、大鼠骨骼肌细胞中，PKCδ不参与钙信号刺激的GLUT4转位；PKCα和PKCθ参与钙信号促进的AS160和TBC1D1的磷酸化；AS160参与钙信号调节的GLUT4转位；Rab10不参与钙信号调节的GLUT4转位；Rab13参与钙信号调节的GLUT4外排。 2、大鼠骨骼肌细胞中，短链脂肪酸可促进GLUT4转位，增加GLUT4蛋白表达，促进AMPK和ACC的磷酸化，抑制棕榈酸诱导的JNK和NF-κB的激活以及SOCS3的表达。 3、小鼠肝细胞中，短链脂肪酸可促进AMPK、ACC、GSK-3β的磷酸化。 4、内皮细胞中，丙酸可促进AMPK的磷酸化，抑制棕榈酸诱导的JNK和NF-κB激活。

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