瑞芬太尼通过纠正锌稳态失衡保护缺血/再灌注心脏

摘要

本文主要从以下几方面展开论述： 第一部分 瑞芬太尼通过纠正锌稳态失衡而发挥其抗心肌缺血/再灌注损伤作用 目的： 尽管已有研究证实锌稳态失衡与心肌缺血/再灌注损伤密切相关，但是关于锌转运蛋白表达如何影响锌稳态失衡以及其在心肌缺血/再灌注损伤中的具体作用尚不清楚。瑞芬太尼（Remifentanil）已被证实可减轻心肌缺血/再灌注损伤，但其相应分子机制尚未完全阐明。本部分的研究目的是证明瑞芬太尼能否通过纠正锌稳态失衡发挥其抗心肌缺血/再灌注损伤的作用。 方法： 利用Langendorff模型建立离体大鼠局部心脏缺血/再灌注模型，缺血时间为30min，再灌注时间为2h。瑞芬太尼于缺血前30min给予，5min/次，每次间隔5min，共3个循环。通过伊文氏蓝+TTC染色法测定心肌梗死面积；用电感耦合等离子体发射光谱仪检测心脏锌离子含量；用Western blotting法测定心肌危险区金属应答转录因子1（Metal responsive factor1,MTF1）及锌转运蛋白1（Zinc transporter1,ZnT1）的表达。利用H9c2细胞建立缺氧/复氧模型，瑞芬太尼于缺氧前2h预先给药。采用CCK8法测定各组细胞存活率，利用锌离子探针Newport Green DCF检测细胞锌离子含量，构建MTF1过表达质粒并于缺氧前48h转染至H9c2细胞内，通过Western blotting法检测ZnT1的表达，并在激光共聚焦显微镜下观察细胞内锌离子含量的变化。 结果： 在大鼠心脏缺血再灌注及H9c2细胞缺氧/复氧模型上，瑞芬太尼可明显降低心肌梗死面积、提高心肌细胞存活率。用电感耦合等离子体发射光谱仪检测大鼠离体心脏缺血/再灌注后心肌锌离子水平后发现，缺血/再灌注可明显降低心肌组织锌离子含量，瑞芬太尼预处理后心肌组织锌离子含量明显升高。进一步的实验利用荧光探针检测了细胞锌离子含量，结果与离体模型数据相吻合。Western blotting检测结果显示，与假手术组相比，缺血/再灌注可诱导大鼠心肌组织MTF1及ZnT1的表达上调，而瑞芬太尼使再灌注心肌MTF1及ZnT1的水平降低。利用pCMV-Tag2B载体构建MTF1过表达质粒并转染入H9c2细胞后发现，MTF1过表达可拮抗瑞芬太尼对ZnT1表达的抑制作用，细胞锌离子水平也随之降低。 结论： 心肌缺血/再灌注通过上调MTF1水平来促进细胞膜上锌离子转出蛋白ZnT1表达，促进心肌细胞内锌离子外流，引起心肌损伤。瑞芬太尼通过抑制MTF1和ZnT1的表达而减少心肌细胞锌离子外流，从而保护心肌。 第二部分 瑞芬太尼通过抑制锌离子丢失所致内质网应激而减轻心肌线粒体损伤 目的： 内质网结构及功能的稳定是线粒体正常运转的重要前提。研究已经证实，外源性锌通过抑制内质网应激阻止线粒体通透性转换孔开放，从而对再灌注心肌发挥保护作用。本部分的研究目的是探讨瑞芬太尼是否通过防止锌离子丢失而抑制内质网应激，进而改善再灌注心肌线粒体损伤。 方法： 建立大鼠离体心脏Langendorff灌流模型，模型稳定20min后分别给予锌离子螯合剂N,N,N',N'-四（2-吡啶甲基）乙二胺（N,N,N',N'-tetrakis-(2-pyridylmethyl)ethylenediamine,TPEN）（20μM,5min）或内质网应激激动剂毒胡萝卜素（Thapsigargin,TG）（1μM,15min）。随后给予瑞芬太尼（100ng/mL）进行灌流。给药结束后施行心肌缺血/再灌注。用Powerlab数据采集分析系统记录心率和左心室发展压变化，测定各组大鼠心脏冠脉流量。实验结束后永久结扎冠状动脉，用伊文氏蓝联合2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色法测定心脏组织梗死面积；采集心脏缺血区组织，用Western blotting检测各组内质网应激标志性蛋白（CHOP,BIP）及凋亡指标（cleaved-caspase3,Bax,Bcl2）。利用H9c2细胞建立缺氧/复氧损伤模型，预先转染MTF1过表达质粒或给予TPEN、TG、瑞芬太尼等进行干预，用CCK8试剂盒测定各组细胞存活率；用Western blotting检测CHOP及BIP；用DCFH-DA染色及Mitosox Red染色检测细胞和线粒体活性氧水平；采用JC-1染色法观察各组细胞线粒体膜电位的改变。 结果： 在大鼠Langendorff模型上，心肌缺血/再灌注所致细胞锌离子丢失可触发内质网应激，而瑞芬太尼预处理通过抑制锌离子外流减轻内质网应激。锌离子螯合剂TPEN或内质网应激激动剂TG干预可抑制心功能、加重心肌梗死面积和心肌细胞凋亡。在H9c2细胞缺氧/复氧模型中，MTF1过表达质粒使内质网与锌离子的共定位减少，拮抗瑞芬太尼对内质网应激的抑制作用。与此同时，瑞芬太尼可抑制活性氧产生并防止线粒体膜电位的降低，这些作用均被TPEN或TG所阻断。 结论： 心肌缺血/再灌注所致心肌细胞锌离子外流使内质网锌离子丢失而触发心肌细胞内质网应激，从而引起线粒体和心肌细胞损伤。瑞芬太尼预处理通过抑制心肌细胞锌离子丢失而减轻内质网应激及线粒体损伤，从而发挥心肌保护效应。

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