Tudor-SN通过调控染色质重塑促进DNA损伤修复的分子机制

摘要

目的： 人体在自然条件下，会被环境中各种刺激因素以及细胞内源性应激造成DNA发生损伤，严重影响了细胞内信息遗传和基因编码的方式。在遭受刺激后，细胞会通过激活一套完整精细的过程，包括DNA断裂识别，检查点的激活，染色质重塑，DNA修复，周期阻滞和细胞凋亡等，防止错误信息影响细胞自身功能，维护基因组的稳定性，保护机体功能的正常运行。Tudor-SN（Tudor staphylococcal nuclease）作为一个转录共激活因子，在很多细胞进程中发挥作用，比如：pre-mRNA剪接加工，细胞周期调控，应激颗粒形成，脂质代谢，肿瘤侵袭迁移等。近期研究报道，Tudor-SN与细胞凋亡以及化疗药物抵抗密切相关。我们实验室前期结果也发现Tudor-SN可以与一些损伤修复蛋白结合，但其作用和具体机制尚不明确。本课题主要目的是探讨Tudor-SN在DNA损伤修复中的功能及其分子机制。 方法： 本课题主要分六部分进行： 第一部分，在不同细胞系中观察Tudor-SN与损伤修复蛋白的结合情况。首先采用质谱技术，在IR后用Tudor-SN蛋白钓取损伤修复相关蛋白，然后在Hela和MEF细胞中利用免疫共沉淀方法进一步验证Tudor-SN与其在胞内的结合情况。 第二部分，检测Tudor-SN与IR后细胞存活之间的联系。首先利用MTT技术，检测IR后Tudor-SN对细胞存活率的影响，同时用克隆形成实验检测细胞对IR的敏感性，最后检测IR后细胞的凋亡情况以及凋亡蛋白的表达。 第三部分，探讨损伤后PARP1对Tudor-SN的募集和修饰作用。利用免疫共沉淀和GST-pull down技术检测PARP1与Tudor-SN不同片段的结合及其修饰激活情况，然后利用Laser照射进一步说明PARP1对Tudor-SN的募集作用。 第四部分，探讨Tudor-SN在核内损伤部位的功能。利用免疫共沉淀技术检测Tudor-SN与染色质重塑蛋白的结合情况，同时用western blot技术检测IR后组蛋白的乙酰化修饰水平，ChIP技术检测损伤部位组蛋白的修饰情况。 第五部分，检测Tudor-SN是否影响损伤修复通路的激活。通过western blot，细胞免疫荧光技术观察ATM-H2AX及其下游通路的激活情况，并用共聚焦显微镜观察Tudor-SN与γ-H2AX的共定位。 第六部分，探讨Tudor-SN对损伤修复的影响。通过彗星实验检测修复的情况，同时检测IR后细胞周期的阻滞，利用构建好的细胞系检测Tudor-SN是否参与HR和N HEJ两种修复途径。 结果： 1.质谱结果显示Tudor-SN可以钓到很多损伤修复蛋白，免疫共沉淀检测发现Tudor-SN与多种损伤修复蛋白（MDC1、RAD50、Ku70、53BP1、XRCC1、POLB）相互结合，并且在IR后结合增多。 2.MTT及克隆形成实验检测发现Tudor-SN缺失可造成细胞在IR后的存活率降低，流式检测发现Tudor-SN缺失后细胞凋亡增多，western检测发现促凋亡蛋白表达增多，抑凋亡蛋白表达降低。 3.免疫共沉淀和GST-pull down实验发现PARP1与Tudor-SN在胞内胞外都能稳定结合，其中SN片段发挥主要作用。IR后PARP1可使Tudor-SN发生PAR修饰，laser及染色质提取实验检测发现IR后，Tudor-SN会被PARP1激活并募集到核内损伤部位。 4.免疫共沉淀实验检测发现，损伤后Tudor-SN可以与SMARCA5及GCN5稳定结合，同时利用western和ChIP实验检测发现Tudor-SN可以募集染色质重塑因子，改变组蛋白的乙酰化水平，进而影响染色质的松弛。 5.Western及免疫荧光实验检测发现，Tudor-SN缺失会导致ATM-H2AX及其下游通路蛋白的磷酸化激活受限，共聚焦结果显示损伤后Tudor-SN与γ-H2AX在细胞核内共定位增多。 6.周期检测发现IR后细胞发生G2/M期阻滞，但Tudor-SN缺失会导致G2/M期阻滞减少，彗星实验发现Tudor-SN缺失导致修复受限。此外，Tudor-SN缺失导致IR后DR-GFP-U2OS细胞和NHEJ-GFP-HEK293细胞中GFP表达降低。 结论： 1.IR后Tudor-SN可与多种损伤修复蛋白稳定结合，参与DNA损伤修复进程。 2.Tudor-SN缺失造成细胞在IR后的存活率降低，细胞凋亡增多，对IR更敏感。 3.损伤早期PARP1与Tudor-SN在IR后能稳定结合，并使Tudor-SN发生PAR修饰而被募集到核内损伤部位发挥作用。 4.Tudor-SN在核内通过与SMARCA5和GCN5结合，改变组蛋白的乙酰化水平，进而影响损伤早期染色质的松弛，利于修复的进行。 5.Tudor-SN影响ATM及其下游通路的激活，缺失后可导致ATM-H2AX及其他下游蛋白的激活受限，损伤修复信号传导受到抑制。 6.Tudor-SN缺失导致IR后细胞G2/M期阻滞减少，修复时间缩短，造成受损细胞修复受限。此外，Tudor-SN可以参与HR和NHEJ两种修复途径来促进细胞在IR损伤后的存活。

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