PCSK9单克隆抗体2种活性检测方法的建立及应用

摘要

大量研究表明,循环中LDL-C水平升高,是引发动脉粥样硬化及其相关心血管疾病的重要危险因素.目前广泛用于临床上降脂的他汀类药物,并不能将所有人群血清LDL-C降至理想水平并有效防治心血管疾病.以此为背景,国内外掀起了抗前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin type9,PCSK9)单克隆抗体降脂药物的研发热潮.目前,尚没有公开发表可直接应用于PCSK9单抗研发生产过程的抗原结合活性和生物学活性检测方法. 目的：本研究拟建立PCSK9单克隆抗体抗原结合活性和生物学活性测定方法,用于PCSK9单抗药物研究开发过程中的活性质量控制工作,为同类单克隆抗体药物活性方法的开发提供借鉴. 方法：1、在本实验室前期研究的基础上,经发酵、纯化,得到抗体蛋白原液.分别采用CIEF、CE-SDS、紫外分光光度法、凝胶限度检查法、酸度计法等方法测定原液的等电点、纯度、含量、杂质(蛋白A和内毒素)和PH值,对其质量进行检定. 2、根据间接ELISA法的实验步骤,依次考察三个关键实验因素：1)三种二抗：HRP-山羊抗人IgG Fc、HRP-山羊抗人IgG(H+L)、HRP-山羊抗人κ轻链Fab;2)两种包被策略：常规直接包被和链霉亲和素-生物素系统捕获包被;3)二抗稀释比例和PCSK9抗体蛋白浓度梯度,建立检测PCSK9单抗抗原结合活性的间接ELISA法. 3、培养HepG2肝癌细胞,逐一考察关键实验因素：1)铺板培养基FBS含量、细胞培养时间及Dil-LDL孵育时间;2)铺板细胞密度;3)PCSK9蛋白浓度;4)Dil-LDL浓度;5)供试品浓度梯度,建立PCSK9单抗药物的生物学活性测定方法. 4、依据药典,验证两方法的专属性、准确度、精密度、线性与范围、耐用性. 5、采用所建立两种方法,测定本实验室生产的三批PCSK9单抗的抗原结合活性和生物学活性. 结果：1、纯化后得到浓度为123.5g/L的PCSK9抗体原液1.26L.经测定,等电点为7.059;还原CE-SDS重链和轻链之和为95.9%,非还原CE-SDS纯度94.0%;SE-HPLC纯度98.9%;PH值5.28;内毒素小于10eu/ml;蛋白A含量0.61ppm,均符合PCSK9单抗原液质量标准. 2、综合考虑OD值、四参数曲线的拟合情况和实验成本、效率,确定关键实验参数：1)链霉亲和素-生物素系统捕获包被PCSK9蛋白;2)抗体浓度梯度：1350ng/ml~0.023ng/ml(3倍梯度);3)二抗：HRP-山羊抗人IgG(H+L)(1：10000比例稀释).建立测定PCSK9单抗抗原结合活性的方法. 3、综合考虑相对荧光强度(RFU)响应值、四参数曲线拟合情况和实验成本、效率基础,确定如下关键参数：1)10%FBS铺板培养基,细胞培养24h,Dil-LDL孵育20h;2)细胞铺板密度5×105个/ml;3)PCSK9蛋白浓度20μg/ml;4)Dil-LDL浓度16μg/ml;5)抗体浓度梯度：200、52、20、12、8、4、0.8μg/ml.建立测定PCSK9单抗生物学活性的方法 4、经分别验证,所建立两种方法的专属性、准确度、精密度和耐用性均符合验证标准,且在50%~150%效价水平范围内,均呈现良好线性关系. 5、用所建立方法测定的三批抗体样品抗原结合活性分别为74.7%、88.9%、76.2%(RSD9.8%);生物学活性分别为80.4%、76.3%、75.5%(RSD3.4%),均符合质量标准. 结论：成功建立PCSK9单抗药物抗原结合活性和生物学活性的测定方法,用于PCSK9单抗药物体外活性的质量控制工作.

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Abstract

缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、PCSK9单克隆抗体的表达、纯化及质量分析

1.1对象和方法

1.1.1主要试剂

1.1.2主要设备及耗材

1.1.3实验方法

1.2结果

1.2.1发酵表达结果

1.2.2纯化结果

1.2.3质量分析结果

1.3讨论

1.4小结

二、抗原结合活性检测方法的建立

2.1对象与方法

2.1.1主要试剂

2.1.2主要仪器及关键耗材

2.1.3主要试剂配制

2.2结果

2.2.1关键实验条件确定

2.2.2方法验证结果

2.3讨论

2.3.1间接ELISA法

2.3.2包被体系选择

2.3.3方法验证

2.4小结

三、生物学活性检测方法的建立

3.1对象和方法

3.1.1细胞株

3.1.2主要试剂

3.1.3主要设备及关键耗材

3.1.4主要溶液配制

3.1.5实验方法

3.2结果

3.2.1细胞培养结果

3.2.2关键实验条件选择确定

3.2.3方法验证结果

3.3讨论

3.3.1细胞要求

3.3.2关键实验条件探索

3.3.3方法验证

3.4小结

四、两种活性检测方法的应用

4.1对象和方法

4.1.1实验试剂

4.1.2主要设备及关键耗材

4.1.3主要试剂配制

4.1.4实验方法

4.2结果

4.2.1三批PCSK9单克隆抗体抗原结合活性检测结果

4.2.2三批PCSK9单克隆抗体生物学活性检测结果

4.3讨论

4.4小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述

PCSK9靶向降脂药物的研究现状以及未来的前景分析

综述参考文献

致谢

个人简历