Nrf2通过自噬参与大鼠切口痛-瑞芬太尼痛敏调节

摘要

目的： 阿片类药物是临床中目前最常用的一类强效镇痛药，被广泛应用于术中镇痛和各类中重度疼痛的治疗中，具有重要的临床地位。临床应用中阿片类药可诱发多种副作用,其中接触阿片药物后诱发的痛觉过敏（简称痛敏）即OIH（opioid-induced hyperalgesia）与此类药物的镇痛作用恰好相反，被越来越多学者关注。术中应用阿片类药物而诱发OIH的患者，术后疼痛控制困难、镇痛药用量增加，甚至可以使疼痛迁延发展为慢性疼痛，使病情复杂化，但由于机制不明而缺乏有效解决方案。瑞芬太尼是超短效MOR激动剂，其独特的药物代谢动力学特性符合临床麻醉安全有效又可控性强的要求，被频繁选择应用于全麻手术静脉镇痛。同时相比于其他阿片制剂瑞芬太尼更容易发生OIH,引起术后痛敏(postoperative hyperalgesia,POH),影响其临床应用，所以，其机制研究有着重要临床意义。 自噬是一种细胞“自食”现象。这一过程中细胞将多余的需要吞噬、降解的细胞内分子或细胞器如蛋白质、脂质、线粒体等包裹在双层膜结构的自噬小体内，再与溶酶体融合把包裹物降解供细胞再利用。已知自噬参与多种生理病理过程。自噬能通过调节细胞内物质代谢、氧化还原平衡改善神经神经细胞功能，具有神经保护作用。Nrf2不仅是机体内抗氧化应激系统的中枢分子，也是多种自噬相关基因的转录因子，与自噬相互交叉调节。近来，大量报道发现自噬参与疼痛调节及阿片类药物的体内作用。 本研究中，课题组以切口痛-瑞芬太尼痛敏模型大鼠为研究对象，测定了模型动物脊髓自噬相关蛋白及Nrf2转录表达情况，并通过自噬调节剂3-MA、Nrf2调节剂tBHQ干预，测定脊髓中相应分子及模型动物的痛敏行为学变化，进行统计学分析以明确自噬、Nrf2与瑞芬太尼致切口痛觉过敏的关系。 方法： 实验由两部分组成。 第一部分：切口痛-瑞芬太尼痛敏大鼠脊髓内自噬的改变及影响。40只大鼠随机分为对照组（C组）、瑞芬太尼输注组（R组）、切口组（I组）、切口+瑞芬太尼输注组（RI组）和切口+瑞芬太尼输注+自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤干预组（MA组），各8只。先建立瑞芬太尼输注的切口痛敏模型，于T0-4（造模前1d、造模后2h、6h、24h、48h）通过测定行为学指标MPW、PWL判断造模结果。于造模后痛敏高峰期（T4）取大鼠的腰膨大部脊髓组织，用蛋白质印迹法检测LC3Ⅱ、Beclin-1、p62的表达。腹腔注射自噬抑制剂3-MA反向调节自噬，测定行为学变化及T4时脊髓标本内p62、LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表达，分析自噬蛋白变化与痛敏的可能联系。 第二部分：切口痛-瑞芬痛敏大鼠脊髓Nrf2-自噬信号通路的变化及影响。大鼠随机分为切口组（I组）、切口+瑞芬太尼输注组（RI组）、切口+瑞芬太尼输注+Nrf2激动剂干预组（tBHQ组）共3组。于T0-4测定行为学指标MPW、PWL。取T4时大鼠脊髓标本检测Nrf2及其下游信号蛋白HO-1的表达水平（包括蛋白及mRNA）、AGT蛋白（LC3Ⅱ、Beclin-1）以及氧化还原状态指标（MDA、SOD含量）。以Nrf2激动剂tBHQ腹腔注射反向调节Nrf2，测定行为学变化及T4时以上相关分子表达情况，分析Nrf2-自噬信号通路与痛敏的可能联系。 结果： 1、第一部分：行为学指标：与C组比较，I组、R组、RI组的MPW、P WL数值明显减少（P＜0.01）；RI组分别与R组、I组比较，MA组与RI比较，MPW、PWL数值明显减少（P＜0.01）。蛋白质印迹：与C组对比，R组、RI组脊髓标本内ATG蛋白LC3Ⅱ、Beclin-1上调，p62下调，I组只有LC3Ⅱ上调（均P＜0.05）；MA组与RI对比，LC3Ⅱ、Beclin-1下调、p62上调（P＜0.05）。 2、第二部分：RI组与I组比较,MPW、PWL数值明显减少，AGT蛋白LC3Ⅱ和Beclin-1增多、Nrf2蛋白增多、HO-1蛋白及mRNA减少、SOD减少、MDA增多（均P＜0.05）；tBHQ组与RI组比较，MPW、PWL数值上升（P＜0.05），Nrf2蛋白表达增加、HO-1蛋白及mRNA表达增多、SOD增多、MDA减少、LC3Ⅱ和Beclin-1蛋白表达增高（P＜0.05）。 结论： 1、术中输注瑞芬太尼加重大鼠术后切口痛觉过敏。 2、切口-瑞芬太尼输注组大鼠腰膨大部脊髓内的AGT蛋白发生明显改变,提示瑞芬太尼输注可能影响切口痛大鼠的脊髓自噬活性。 3、腹腔注射自噬抑制剂3-MA可以进一步恶化瑞芬太尼输注所致的切口痛觉过敏，自噬在该痛觉过敏中具有保护作用，可能成为其预防和治疗中新的调控点。 4、切口-瑞芬太尼输注组大鼠腰膨大部脊髓内转录因子Nrf2的转录活性受到抑制。 5、Nrf2激活剂tBHQ改善瑞芬太尼输注导致的切口痛觉过敏、进一步激活了大鼠脊髓内自噬，提示Nrf2-自噬信号通路可能参与瑞芬太尼加重切口痛觉过敏的调节。

目录

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