KDM6A在牙周膜干细胞成软骨向分化中的作用及机制研究

摘要

目的： 临床上以骨关节病（osteoarthritis,OA）为代表的软骨缺损疾病较为常见，严重降低患者的生活质量。由于软骨基质中缺乏神经、血管而不能完全再生，因此在软骨缺损修复中，干细胞引导的组织再生引起越来越多的关注。牙周膜干细胞（Periodontal ligament stem cells,PDLSCs）具有多向分化潜能，且较脐带沃顿间充质干细胞（WJCMSCs）与骨髓间充质干细胞（BMMSCs）相比具有更高的多向分化潜能。同时其来源广泛，不涉及伦理问题，可作为理想的种子细胞，但牙周膜干细胞分化机制尚不明确，限制了其在组织再生中的应用。在干细胞分化过程中，表观遗传学调控起到重要作用。KDM6A是主要的H3K27去甲基化酶，有研究证实，KDM6A与干细胞多向分化有关，KDM6A能促进间充质干细胞（MSCs）成骨分化，抑制其成脂分化，然而，KDM6A在干细胞成软骨分化中作用尚不明确。本课题旨在研究KDM6A对PDLSCs成软骨分化的影响，并探究其对软骨再生影响的机制，为牙源性干细胞介导的软骨组织再生奠定基础，促进牙源性干细胞在组织再生中的临床转化。 本课题探讨了KDM6A对PDLSCs成软骨分化潜能的影响及其作用机制，以及EZH2抑制剂对KDM6A敲低后PDLSCs成软骨分化能力影响的研究。 方法： 本实验收集因正畸治疗拔除的健康前磨牙和因阻生拔除的第三磨牙，采用酶消化法分离培养牙周膜干细胞，对体外培养的PDLSCs进行成软骨诱导分化，观察其成软骨分化能力。使用慢病毒转染的方法敲低KDM6A，RT-PCR检测敲低效率。对正常及敲低KDM6A后的PDLSCs进行成软骨分化诱导，于诱导2周时进行阿辛蓝染色及定量分析，并采用蛋白质印迹法对SOX9蛋白质表达水平进行检测。采用RT-PCR方法检测0天、3天、1周、2周和3周时成软骨相关分子SOX9、Col2a1、ACAN的表达，采用细胞爬片免疫荧光技术和蛋白质印迹法检测PDLSCs中H3K27me3及H3K4me3水平。使用EZH2抑制剂，观察敲低KDM6A后PDLSCs的成软骨分化能力及其组蛋白甲基化水平变化。使用SPSS16.0进行统计学分析，计量资料采用方差分析，P<0.05时表示差异有统计学意义。 结果： 敲低KDM6A对PDLSCs细胞增殖及凋亡无影响。敲低KDM6A能减少PDLSCs产生的蛋白多糖和胶原，并能减少SOX9的表达，而EZH2抑制剂（EPZ-6438）能拮抗敲低KDM6A对SOX9的抑制作用。敲低KDM6A后SOX9、Col2a1、ACAN表达水平均降低，而使用EPZ-6438后，PDLSCs-KDM6Ash组细胞中SOX9、Col2a1、ACAN的表达水平有所升高。KDM6A敲低后，PDLSCs中H3K4me3水平降低，H3K27me3水平升高，启动子区H3K27me3水平升高而H3K4me3水平降低；使用EPZ-6438后，与敲低KDM6A组相比H3K4me3水平升高，H3K27me3水平降低。 结论： KDM6A在PDLSCs成软骨向分化过程中起正向调控作用，其机制可能是KDM6A影响成软骨分化相关基因的组蛋白甲基化水平，采用EZH2抑制剂可能挽救或部分挽救KDM6A敲低引起的组蛋白甲基化水平变化。提示过表达KDM6A或使用EZH2抑制剂在骨关节炎等软骨缺损疾病的治疗中可能具有价值。

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