长链非编码RNA Linc00675在肺癌中的表达及对细胞侵袭转移的影响

摘要

背景： 肺癌是发达国家和发展中国家男性癌症死亡的主要原因，并且它已经超过了乳腺癌，成为发达国家女性癌症死亡的主要原因之一。肺癌分为两个主要组织学类型：小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）。其中85%为NSCLC，尽管近年来肺癌的诊断及治疗等方面飞速发展，但是其5年生存率仍没有得到明显提高。高死亡率的关键原因是肿瘤的转移潜能。因此，更好地了解肿瘤细胞侵袭转移的分子机制是更有效的NSCLC管理的必要条件。然而目前为止还没有肿瘤分子标志物能够准确地预测出肺癌的转移。因此，筛选和鉴定能够准确地预测出肺癌转移过程中相关的生物分子标记物是目前肺癌研究进程中的一个重要的组成部分。 在过去的几十年中，许多分子流行病学研究表明，某些蛋白质编码基因（EGFR，KRAS）的突变在非小细胞肺癌的发病机制中发挥重要作用。然而，最近的进展表明，另一种重要类型的基因，非编码基因也可能在癌症进展中成为新的参与者。非编码RNA，是一类不具有蛋白质编码能力的RNA分子。其中长链非编码RNA（longchainnon-coding RNA，lncRNA）是一类被定义为长度超过200个核苷酸的RNA，尽管lncRNA不具有蛋白质编码能力，但其能够通过转录、表观修饰及转录后调节等途径来参与基因表达的调控。在肺癌、结直肠癌及胃癌等恶性肿瘤的研究中，lncRNA的异常表达常被发现，并且有可能与恶性肿瘤的发生发展过程相关。 目的： 在本次研究中，我们首先利用了人类lncRNA芯片技术在5对分别含有淋巴结转移呈阴性和阳性的肺癌组织样本中筛选出具有差异表达的lncRNA。依据lncRNA芯片最终的分析结果，然后选择了在5对肺癌组织样本中差异表达较为明显的linc00675作为我们本次实验的研究重点。通过对临床信息进行统计分析、细胞功能实验、体内动物实验和分子生物学实验，探索研究linc00675与临床预后的关系，对肺癌细胞系功能的影响，进一步探讨linc00675潜在的分子机制。 方法： 首先利用了人类lncRNA芯片技术在5对分别含有淋巴结转移呈阴性和阳性的肺癌组织样本中筛选出具有差异表达的lncRNA。其中将差异表达较为明显的linc00675作为我们本次实验的研究重点。qRT-PCR实验进一步验证分析30对分别含有淋巴结转移呈阴性和阳性的肺癌组织中的linc00675。接下来我们进一步增大组织样本量和收集完善样本中的病例资料，通过qRT-PCR实验检测及相关的统计分析linc00675在110例肺癌组织样本中的表达水平并且与临床病理因素和临床患者预后的相关性。首先设计出上调和下调linc00675表达的序列，采用慢病毒感染对数期生长的肺癌细胞系A549和Calu3来构建稳定上调和下调表达linc00675的细胞株。MTT实验用来检测A549和Calu3的增殖活力；划痕实验和Transwell实验用来检测A549和Calu3的迁移侵袭能力；裸鼠异种肺转移瘤模型实验观察linc0067在体内对肺癌细胞转移的影响。采用Western blot方法初步研究linc00675促进肺癌细胞表型的分子机制。 结果： 30对验证样本中qRT-PCR分析结果显示，与淋巴结转移呈阴性的肺癌组织相比较，linc00675的表达在含有淋巴结转移呈阳性的肺癌组织中较低（P＜0.05）。通过对110例肺癌患者的临床病理因素与linc00675的表达水平的统计分析，我们发现linc00675的表达与肺癌患者的TNM分期和淋巴结转移具有相关性（P＜0.05）。Kaplan-Meier生存曲线表明linc00675低表达的肺癌患者的总生存期（OS）和无病生存期（DFS）明显差于linc00675高表达的患者（P＜0.05，P＜0.05）。多因素Cox回归模型显示，linc00675表达是肺癌患者的独立的预后因素。MTT研究结果显示：在肺癌细胞系中，无论进行上调或者下调linc00675的表达，与对照组相比，实验组中的细胞增殖活力均没有出现显著的变化。然而划痕和Transwell迁移侵袭实验结果显示：在肺癌细胞系中，当上调linc00675表达之后，与对照组相比，实验组中的细胞迁移和侵袭能力得到明显的减弱，并且当下调linc00675表达之后，与对照组相比，实验组中的细胞迁移和侵袭能力得到明显的增强。裸鼠异种肺转移瘤模型实验结果表明，linc00675过表达能够减弱A549细胞在体内的转移侵袭能力。Western blot结果表明linc00675可能通过影响MMP2和MMP9影响NSCLC细胞的侵袭和转移。 结论： 与淋巴结转移呈阴性的肺癌组织相比较，linc00675的表达在含有淋巴结转移呈阳性的肺癌组织中较低，并且linc00675的表达与TNM分期和淋巴结转移具有相关性，是肺癌患者的独立的预后因素。体外细胞和体内动物实验表明linc00675减弱细胞的转移侵袭。linc00675可能通过影响MMP2和MMP9影响NSCLC细胞的侵袭和转移。linc00675有可能成为预测NSCLC患者进展及生存的分子标记物。

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