PCB153暴露293T细胞导致LINE-1表达及转座的研究

摘要

目的： 多氯联苯（polychlorinated biphenyls，PCBs）是一类具有持久性、生物蓄积性、高毒性的有机污染物。2,2',4,4',5,5'-六氯联苯（2,2',4,4',5,5'-hexachlorobiphenyl,PCB153）是人体组织中含量最多的PCBs同系物之一，与人类健康关系密切。PCB153可导致DNA损伤，基因组不稳定等。长散在重复序列-1（long interspersed element-1,LINE-1)是人类基因组中唯一可以自主转座的逆转座子，LINE-1发生转座可降低基因组稳定性。本研究分析了PCB153暴露下，人肾上皮细胞系（293T细胞）中LINE-1的表达及转座、细胞凋亡和DNA损伤情况，为PCBs的分子毒理学研究提供新思路。 方法： （1）流式细胞法检测293T细胞的凋亡情况。 （2）荧光定量技术（Real-time PCR）检测LINE-1mRNA基因的表达水平。蛋白质免疫印记技术（Western blot）检测LINE-1蛋白表达水平。 （3）Real-time PCR检测LINE-1在基因组上的拷贝数。 （4）焦磷酸测序技术检测LINE-1启动子区域甲基化状态。Real-time PCR技术检测甲基化相关基因mRNA的表达水平。 （5）免疫荧光技术检测293T细胞的DNA损伤情况。Real-time PCR技术检测DNA损伤修复相关基因mRNA的表达水平。 结果： （1）与对照组相比，15μmol/L PCB153可致293T细胞凋亡率增加。 （2）与对照组相比，不同浓度PCB153（5μmol/L，10μmol/L，15μmol/L）作用293T细胞48h后，细胞中LINE-1mRNA的表达升高。在染毒96h时，LINE-1蛋白表达升高，且差异最为明显。 （3）与对照组相比，不同浓度PCB153（5μmol/L，10μmol/L，15μmol/L）作用293T细胞96h后，细胞中LINE-1拷贝数均增加。15μmol/L PCB153染毒组差异最为明显。 （4）在染毒96h时，与对照组相比，15μmol/L PCB153可导致293T细胞中LINE-1甲基化水平下降。同时，293T细胞中甲基化酶DNMT3B基因mRNA表达量下降，去甲基化酶TET1基因mRNA表达量升高。 （5）在染毒96h时，与对照组相比，15μmol/L PCB153可致细胞发生DNA损伤。与对照组相比，15μmol/L PCB153可导致293T细胞中RAD51D和XRCC2mRNA表达量下降，XRCC5和XRCC6mRNA表达量升高。 结论： （1）PCB153暴露可诱导293T细胞凋亡。 （2）PCB153暴露能降低LINE-1甲基化，增加LINE-1表达量，可能诱导LINE-1转座。 （3）PCB153暴露可导致DNA损伤，并且对DNA损伤修复有影响。

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Abstract

缩略语

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、PCB153对293T细胞凋亡的影响

1.1 实验材料

1.1.1 细胞株

1.1.2 仪器及耗材

1.1.3 药物及试剂

1.2 研究方法

1.2.2 细胞传代

1.2.3 细胞计数

1.2.4 分组染毒与细胞收集

1.2.5 细胞凋亡检测

1.2.6 统计学分析

1.3 实验结果

1.3.1 293T细胞形态学观察

1.3.2 细胞凋亡

1.4 讨论

1.5 小结

二、PCB153对293T细胞中LINE-1表达及拷贝数的影响

2.1 实验材料

2.1.1 仪器及耗材

2.1.2 试剂

2.1.3.2 1×电泳液

2.1.3.3 1×电转液

2.1.3.4 5%脱脂牛奶

2.1.3.5 30%丙烯酰胺储存液

2.1.3.6 10% SDS

2.1.3.7 10% AP

2.1.3.8 引物的配置

2.2 研究方法

2.2.1 技术路线

2.2.2 细胞内LINE-1 mRNA表达水平测定

2.2.2.1 RNA提取及纯度测定

2.2.2.2逆转录反应

2.2.2.3 Real-time PCR

2.2.3.2蛋白浓度测定

2.2.3.3 Western blot

2.2.4.1 DNA提取及浓度测定

2.2.4.2 Real-time PCR

2.3 实验结果

2.3.1 PCB153对LINE-1 mRNA表达的影响

2.3.2 PCB153对LINE-1蛋白表达的影响

2.3.3 PCB153对LINE-1拷贝数的影响

2.4 讨论

2.5 小结

三、PCB153对293T细胞中LINE-1甲基化的作用

3.1 实验材料

3.2 研究方法

3.2.1 技术路线

3.2.2 亚硫酸氢钠修饰及纯化

3.2.3 甲基化PCR扩增

3.2.3.1 引物合成

3.2.3.2 PCR反应体系（50μL）

3.2.3.3 PCR反应条件

3.2.4 焦磷酸测序

3.3 实验结果

3.3.1 PCB153对LINE-1甲基化的影响

3.3.2 PCB153对甲基化转移酶和去甲基化转移酶基因mRNA表达的影响

3.4 讨论

3.4.1 DNA甲基化的检测方法

3.4.2 LINE-1的甲基化修饰

3.5 小结

四、PCB153诱导293T细胞的DNA损伤

4.1 实验材料

4.1.1 仪器及试剂

4.1.2.4 PBST溶液

4.2 研究方法

4.2.1 技术路线

4.2.2 53BP1免疫荧光检测

4.3 实验结果

4.3.1 PCB153对DNA损伤的作用

4.3.2 PCB153对DNA损伤修复基因表达的影响

4.4 讨论

4.5小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

附录

综述

LINE-1在哺乳动物中的调控作用

综述参考文献

致谢

个人简历