MDSC介导的免疫抑制在骨髓增生异常综合征中作用的研究

摘要

目的： 骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes,MDS)是血液系统恶性克隆性疾病，抗肿瘤免疫异常被认为在MDS发生发展中发挥着重要作用，但其具体机制尚未明确。本研究通过检测并对比MDS患者与正常对照骨髓中髓源性抑制细胞(MDSC)的数量和功能，分析与临床指标的相关性及对效应T细胞(CD8+T细胞)功能的影响，并分选MDSC与CD8+T细胞共培养，检测共培养体系中阻断MDSC的重要功能通路(STAT3通路)前后CD8+T细胞的功能的变化，进一步阐明MDSC介导的免疫抑制在MDS中的作用及其机制。 方法： 纳入的研究对象为天津医科大学总医院血液科2015年10月至2017年12月收治的36例MDS患者及19例健康志愿者，并收集MDS患者的临床数据。 第一部分：应用流式细胞术检测MDS患者和健康对照者骨髓(BM)中以LIN-HLA-DR-CD33+为标记的MDSC细胞比例，并与MDS患者临床指标做相关性分析。第二部分：流式细胞术检测MDS患者和健康对照者MDSC内STAT3活化率，PD-L1和CCR2的表达率；应用ELISA方法检测MDS患者和健康对照者骨髓上清/血浆CCL2和IL-6的浓度。第三部分：流式细胞术检测MDS患者和正常对照者CD8+T细胞PD-1、CD3ζ、穿孔素(Perforin)和颗粒酶B(Granzyme B)的表达；应用ELISA方法检测MDS患者和健康对照者骨髓上清IFN-γ的浓度。第四部分：分选MDSC与CD8+T细胞，体外共培养并加入STAT3阻断剂。应用免疫磁珠分选CD8+T细胞，流式细胞分选仪分选MDSC，应用流式细胞术检测分选后的纯度及STAT3阻断剂前后MDSC的STAT3和ARG1的表达；应用SYBRGreen荧光定量PCR检测STAT3阻断剂阻断前后MDSC内ARG1mRNA的相对表达量；应用流式细胞术检测CTL单独培养、MDSC+CD8+T细胞共同培养及共同培养加入STAT3阻断剂三组之间CD8+T细胞功能分子CD3ζ、Perforin和Granzyme B的表达差异；应用ELISA方法检测三组细胞培养液上清中IFN-γ的浓度差异；应用凋亡试剂盒和流式细胞术检测培养后三组CD8+T细胞凋亡率的差异。 结果： 第一部分：MDS患者MDSC数量分析。（1）MDS组骨髓中MDSC比例明显高于健康对照组(HC)(22.52±13.08%vs8.15±5.75%，P＜0.0001)，依据IPSS评分：高危组(IPSS评分＞1，H-MDS)MDSC比例明显高于低危组(IPSS评分≦1，L-MDS)(26.16±14.29%vs16.82±8.57%，P=0.013)，且H-MDS组和L-MDS组MDSC比例均明显高于HC组(分别为26.16±14.29%vs8.15±5.75%，P＜0.0001和16.82±8.57%vs8.15±5.75%，P=0.024)。依据WPSS评分：H-MDS与L-MDS组MDSC比例差异无统计学意义(23.42±13.22%vs23.25±12.05%，P=0.970)，但H-MDS组和L-MDS组MDSC比例均明显高于HC组(分别为23.42±13.22%vs8.15±5.75%，P=0.009和23.25±12.05%vs8.15±5.75%，P=0.001)。（2）MDSC比例与患者临床相关指标之间的相关分析结果：骨髓原始细胞比例≥5%组MDSC比例较骨髓原始细胞比例＜5%组明显升高(26.53±13.48%vs17.15±8.42%，P=0.033)，且MDS患者骨髓MDSC比例与骨髓原始细胞比例呈正相关(r=0.3897，P=0.033)；染色体核型正常组与异常组MDSC比例无显著性差异(23.54±16.83%vs22.27±10.39%，P=0.603)，预后好、中、差核型三组间均无显著性差异(22.62±14.74%vs27.11±14.30%，P=0.543；22.62±14.74%vs21.54±10.12%，P=0.826；27.11±14.30%vs21.54±10.12%，P=0.475)。 第二部分：MDS患者MDSC功能分析。（1）MDSC内STAT3活化率在IPSS H-MDS组、L-MDS组和HC组分别为49.96±10.88%、41.89±13.20%和32.02±15.27%。组间比较显示H-MDS组和L-MDS组均显著高于HC组(P＜0.01和P=0.039)，且H-MDS组高于L-MDS(P=0.048)；（2）MDSC上CCR2的表达率在H-MDS、L-MDS和HC组分别为12.16±13.80%、20.47±10.12%和6.94±8.54%。组间比较显示：L-MDS组显著高于HC组(P=0.0092)，H-MDS组与HC和L-MDS组无显著性差异(P=0.3232和P=0.1537)；MDSC上PD-L1的表达率在H-MDS、L-MDS和HC组分别为32.79±13.84%、20.71±14.79%和10.84±7.23%。组间比较显示：H-MDS组和L-MDS组PD-L1表达率均显著高于HC组(分别P＜0.001和P=0.038)，且H-MDS组显著高于L-MDS组(P=0.011)。（3）骨髓上清CCL2浓度在H-MDS组、L-MDS组和HC组分别为119.1±65.60pg/mL、132.7±77.82pg/mL和61.39±23.84pg/mL。 第三部分：MDS患者CD8+T细胞功能分析。（1）PD-1表达率在IPSS H-MDS组、L-MDS组和HC组分别为31.97±18.60%、21.43±14.52%和10.28±7.04%。组间比较显示：H-MDS组和L-MDS组均显著高于HC组(P＜0.0001和P=0.030)，且H-MDS组高于L-MDS组(P=0.043)；（2）CD3ζ表达率在IPSS H-MDS组、L-MDS组和HC组分别为1.59±0.77%、4.95±3.3%和10.55±11.10%。组间比较显示：H-MDS组和L-MDS组均显著低于HC组(P=0.001和P=0.044)，H-MDS组高于L-MDS组但差异无显著性(P=0.219)。 第四部分：MDS患者MDSC对CD8+T细胞抑制作用及机制探讨的体外研究。（1）分选后MDSC和CD8+T细胞的纯度均≥90%；（2）MDSC中STAT3和ARG1的表达在阻断组均较未阻断组显著降低(分别为3.112±2.018%vs0.485±0.488%，P=0.0186；31.55±21.61%vs21.15±16.69%，P=0.0031)；（3）MDSC中ARG1mRNA的相对表达量在阻断组均较未阻断组显著降低(1.878±2.064vs0.832±0.969，P=0.0297)；（4）共同培养组(MDSCMDS+CTLMDS)较单独培养组(CTLMDS)中CD8+T细胞CD3ζ、Perforin和Granzyme B的表达均显著降低(分别为3.543±2.056vs6.622±2.128%,P=0.020;8.390±5.181vs15.39±6.595%,P=0.0001;12.98±6.404vs22.31±8.412%,P=0.0003)；共同培养加入阻断剂组(MDSCMDS+CTLMDS+STAT3inhibitor)较无阻断剂组(MDSCMDS+CTLMDS)CD8+T细胞CD3ζ、Perforin和Granzyme B的表达均显著升高(分别为6.198±4.555vs3.543±2.056%,P=0.006;12.58±6.642vs8.390±5.181%,P=0.0036;17.96±9.605vs12.98±6.404%,P=0.0030)。 结论： 1.MDS患者MDSC数量增加，且与疾病危险度相关。 2.MDS患者MDSC的STAT3活化率增高、CCR2表达升高，同时血浆/骨髓上清IL-6、CCL2水平升高，并与STAT3活化呈正相关，提示IL-6、CCL2参与STAT3激活，进而促进MDSC的募集活化；MDS患者PD-L1表达升高，提示MDSC可能通过PD-L1/PD-1通路发挥免疫抑制作用。 3.MDS患者CD8+T细胞高表达抑制分子PD-1，低表达功能分子CD3ζ，以及Perforin，Granzyme B和IFN-γ生成均降低，印证了MDS患者CD8+T细胞功能低下。体外与MDS患者的MDSC混合培养后，CD8+T细胞的功能分子表达愈发降低，凋亡增加；当使用STAT3阻断剂阻断MDSC功能后，CD8+T细胞的上述功能得到一定程度的恢复。 4.MDS患者IL-6、CCL2参与激活MDSC，MDSC可通过STAT3通路调控功能分子ARG1的表达，进而降低CD8+T细胞功能分子CD3ζ、Perforin、Granzyme B和IFN-γ水平表达，导致抗肿瘤免疫异常。另外，MDSC还可通过高表达PD-L1与高表达PD-1的CD8+T细胞作用抑制抗肿瘤免疫。

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