酿酒酵母Pde1的细胞内定位与定位调控机制的研究

摘要

酿酒酵母本身具有两个编码环腺苷酸(cAMP)磷酸二酯酶的基因PDE1和PDE2。它们分别编码低亲和力的cAMP磷酸二脂酶Pde1和高亲和力的cAMP磷酸二脂酶Pde2。低亲和力磷酸二脂酶Pde1在由葡萄糖所诱导的酿酒酵母细胞cAMP信号反应过程中起反馈抑制的作用。Pde1的酶活性是受到PKA磷酸化调节的。但以往的研究发现：在胞外试验中，磷酸化纯化的Pde1并不能改变它对cAMP的低亲和力性或激活其降解cAMP的活性。因此，很可能磷酸化的作用在于使Pde1酶定位于胞内特定的位点，而cAMP趋向于在该位点被降解。本课题研究是先在大肠杆菌与酵母的穿梭质粒YCplac33的多克隆位点上构建PDE1与GFP(编码绿色荧光蛋白)融合基因。再将这一新构建质粒V410导入基因组PDE1基因缺失的菌株YN123、YN100和YN101。菌株YN123的PKA水平是组成型降低的；菌株YN100的PKA水平正常；菌株YN101的PKA水平是组成型升高的。将这些菌株在以甘油(非发酵性碳源)为碳源的合成培养基中培养至对数生长期时，加入葡萄糖诱导细胞。通过免疫荧光检测的方法，检测细胞内Pde1-GFP融合蛋白的细胞内定位。研究发现：生长在非发酵性碳源培养基中的菌株YN123和菌株YN100其Pde1蛋白定位在细胞质内，很有可能集中在内质网或高尔基体上。其中葡萄糖诱导菌株YN123之后，细胞内Pde1-GFP融合蛋白的定位没有明显地变化；葡萄糖诱导菌株YN100之后，细胞内的Pde1-GFP融合蛋白从集中于细胞质内特定的位点(内质网或高尔基体)扩散到细胞质中；而在葡萄糖诱导菌株YN101前后，Pde1-GFP融合蛋白均稳定在细胞质中。这一结果暗示在低PKA活力的细胞(细胞生长在非发酵性碳源培养基中或是胞内PKA水平组成型降低)中，未被磷酸化的Pde1会从细胞质中汇集到内质网或高尔基体上以防止其降解胞内的cAMP；另一方面，在高PKA活力的细胞(细胞生长在葡萄糖培养基中或胞内PKA水平组成型升高)中，Pde1将被磷酸化，并且定位于细胞质中水解cAMP。研究过程中同时发现：在葡萄糖诱导5分钟以后，Pde1-GFP融合蛋白以点状散布在细胞质内。这一现象与生长在非发酵型碳源培养基中的菌株YN123和菌株YN100细胞内Pde1-GFP融合蛋白定位情况类似。这就与先前研究成果相一致即：酵母细胞在葡萄糖上一旦开始发酵型生长，Ras-cAMP通路便会被关闭，另一通路FGM将会取代PKA的作用去激活PKA的目标蛋白。Sch9是目前唯一所知的FGM通路的组分，它对PKA的活力有抑制作用。因此，葡萄糖的加入激活了FGM通路，导致PKA活力的降低，Pde1磷酸化水平下降。研究过程中发现：在已经出芽的酿酒酵母细胞中，Pde1更加集中于芽，并且在芽中则趋向于集中到芽生长位点的顶部。这暗示：Pde1趋向于集中到细胞生长最为旺盛的部位来调节细胞的生长或分化。

目录

文摘

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前言

第一章文献综述

1.1细胞信号转导概述

1.1.1引言

1.1.2跨膜信号转导

1.1.3细胞表面受体的跨膜信号转换

1.1.4 G蛋白与跨膜细胞信号转导

1.2 Ras-cAMP信号通路

1.2.1 cAMP的发现及第二信使学说的提出

1.2.2 Ras-cAMP信号通路组成

1.2.3 cAMP依赖性蛋白激酶(cAPK)

1.2.4 Ras-cAMP通路的反馈抑制调节

1.2.5葡萄糖诱导激活Ras-cAMP通路

1.3本课题研究工作的任务

第二章实验材料与实验方法

2.1实验材料及仪器

2.1.1主要实验仪器

2.1.2试剂

2.1.3酶制剂

2.1.4菌种

2.1.5培养基

2.1.6溶液

2.2实验方法

2.2.1大肠杆菌感受态细胞的制备

2.2.2大肠杆菌的转化

2.2.3质粒的提取(CTAB法)

2.2.4酵母染色体的快速分离

2.2.5 DNA片段的回收纯化

2.2.6酵母细胞的转化

2.2.7 PCR反应体系

2.2.8酶切体系

2.2.9连接体系(20μ1)

2.2.10 GFP荧光定位观察方法

第三章构建研究用质粒和菌株

3.1构建研究用质粒

3.1.1质粒V410的构建

3.2构建PDE1基因缺陷型菌株

3.2.1菌株Sc.YN100和Sc.YN101的构建

3.2.2菌株Sc.YN123的构建

第四章Pde1蛋白的细胞内定位

4.1概述

4.2结果

4.2.1葡萄糖对菌株YN123的诱导效应

4.2.2葡萄糖对菌株YN100的诱导效应

4.2.3葡萄糖对菌株YN101的诱导效应

4.3 Pde1在已出芽的酵母细胞中的分布

4.4讨论

4.4.1葡萄糖诱导下Pde1的亚细胞定位

4.4.2 Pde1在已出芽的酵母细胞中的分布

参考文献

附录

发表论文和参加科研的情况

致谢