木糖利用重组运动发酵单胞菌菌株的构建及其发酵性能的初步评价

摘要

充分利用木质纤维素水解液中的所有组分,是以木质纤维素为原料发酵燃料乙醇的一个关键因素.木糖是木质纤维素中最重要的五碳糖组分,也是自然界仅次于葡萄糖的第二大糖源,因此人们在开发能同时发酵葡萄糖和木糖生成乙醇的微生物菌种上做了很多工作.运动发酵单胞菌能高效发酵葡萄糖生产乙醇,但不能利用木糖.本工作的目的就是构建能发酵木糖产乙醇的重组运动发酵单胞菌菌株. 首先通过PCR扩增得到Peno-talB和tktA基因片段,通过与载体pUC19的连接得到质粒pUC19-Peno-talB/tktA,其中talB和tktA共用一个eno启动子.将Peno-talB/tktA连接到已带有Pgap-xylA-xylB的穿梭载体pZB21上,得到含有四个与木糖代谢有关基因的质粒pZB21-Pgap-xylA/xylB-Peno-ta/B/tktA.通过电穿孔转化此质粒到z mobilis CP4中,对检出的转化子Z mobilis CP4(pZB21-Peno-talB/tktA-Pgap-xylA/xylB)进行的酶活测定表明四个基因均可表达,其中重组菌1<'＃>的酶活水平分别为:XI酶活为0.499U/10min/mg蛋白；XK酶活为0.377U/min/mg蛋白；TAL酶活为0.047U/min/mg蛋白；TKT酶活为0.291U/min/mg蛋白. 通过木糖生长试验确定重组菌不能以木糖为唯一碳源生长.另外,在重组菌的木糖液体生长试验中还发现少量乙醇的生成. 进一步进行的木糖发酵性能初步评价试验结果显示:在6﹪(w/v)的木糖发酵试验中168h时,对照菌木糖利用率为0,且无乙醇的生成；重组菌1<'＃>木糖利用率为35.40﹪,乙醇得率为理论值的52.94﹪.结果说明重组菌具有木糖发酵产乙醇的能力,所构建的木糖代谢途径是成功的.

目录

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前言

第一章文献综述

1.1微生物利用木质纤维素发酵生产乙醇的研究

1.2微生物利用木糖发酵生产乙醇的研究

1.2.1天然菌株利用木糖发酵生产乙醇的研究

1.2.2酿酒酵母和树干毕赤酵母利用木糖发酵生产乙醇工程菌的研究

1.2.3细菌利用木糖发酵生产乙醇工程菌的研究

1.3木糖发酵重组运动发酵单胞菌

1.3.1运动发酵单胞菌介绍

1.3.2木糖发酵重组运动发酵单胞菌

1.4本课题的研究目的、内容和技术路线

1.4.1研究目的

1.4.2研究内容

1.4.3技术路线

第二章实验材料与方法

2.1实验材料

2.1.1菌株与质粒

2.1.2主要试剂

2.1.3主要仪器设备

2.1.4培养基及常用溶液的配制

2.1.5蛋白质含量测定试剂

2.1.6酶活测定试剂的配制

2.1.7 PCR反应引物

2.2实验方法

2.2.1菌株的培养

2.2.2 PCR反应

2.2.3酶切反应

2.2.4电泳分析

2.2.5目的条带的回收

2.2.6连接反应

2.2.7感受态细胞的制备

2.2.8感受态细胞的转化

2.2.9 E. coli质粒的小量提取(SDS-碱裂解法)

2.2.10粗酶液的制备

2.2.11蛋白质浓度测定

2.2.12酶活的测定

2.2.13 Z. mobilis生长曲线的测定

2.2.14发酵液分析方法

第三章实验结果与讨论

3.1 pZB21-Pgap-xylA/xylB-Peno-talB/tktA的构建

3.1.1 pUC19-tktA(change)的构建

3.1.2 pUC19-Peno-talB(change)的构建

3.1.3 pUC19-Peno-talB/tktA的构建

3.1.4 pZB21-Pgap-xylA/xylB-Peno-talB/tktA的构建

3.2 pZB21-Pgap-xx-Peno-tt电穿孔转化Z. mobilis CP4

3.3重组菌酶活测定

3.4重组菌1#生长曲线的测定

3.5重组菌木糖生长试验

3.5.1重组菌的木糖平板生长试验

3.5.2重组菌1#的木糖液体生长试验

3.6重组菌1#发酵性能的初步评价

3.7分析与讨论

第四章结论

4.1结论

4.2建议

符号表

参考文献

附录

发表论文和科研情况说明

致 谢