温度敏感聚异丙基丙烯酰胺/聚精氨酸缀合物转基因载体

摘要

本工作制备了温度敏感性载体聚异丙基丙烯酰胺-聚精氨酸缀合物(PNmArg),考察了PNIPArg和质粒DNlA的相互作用,研究了不同温度下PNIPArg对小鼠成肌细胞(C2C12)的体外基因转染.具体工作主要包括以下方面: 1.制备聚异丙基丙烯酰胺-聚精氨酸缀合物,并采用红外光谱和核磁共振光谱(<'13>C NMR)方法确定产物的形成,浊度方法得到PNIPArg水溶液的低临界转变温度LCST为35.2℃. 2.考察PNIPArg和质粒DNA形成的复合物的物化性质,研究温度响应性对于复合物的形成、复合物的大小以及稳定性的影响.透射电镜的结果表明复合物呈均一的小球状,其粒径分布在50-100nm左右.圆二色谱实验表明,PNIPArg载体对DNA构象的影响不大,温度高于LCST可以使复合物结合地更紧密.琼脂糖凝胶电泳及其酶解实验都表明升高复合物形成的温度可以促进复合物的形成,提高复合物的稳定性. 3. 以C2C12细胞为宿主细胞,考察聚精氨酸载体和温度敏感PNIPArg载体对于介导含有荧光素酶(luciferase)和绿色荧光蛋白(GFP)报告基因系统的质粒PGL3和pEGFP-C1的体外转染.结果证实PNIPArg载体可以成功将质粒DNA导入C2C12细胞,并促使其报告基因的表达.选择不同温度的培养路线可以成功地实现了对转染过程和基因表达过程的温度控制.

目录

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第一章绪论

1.1引言

1.2非病毒载体

1.2.1裸DNA

1.2.2脂质体

1.2.3高分子载体

1.3论文工作的提出

第二章温度敏感聚异丙基丙烯酰胺—聚精氨酸生物缀合物的制备及其与DNA形成复合物的研究

2.1引言

2.2实验部分

2.2.1实验药品

2.2.2聚异丙基丙烯酰胺—聚—L—精氨酸生物缀合物的制备和表征

2.2.3复合物的表征

2.3结果与讨论

2.3.1 PNIPArg的物化性质

2.3.2复合物的表征和温敏性的分析

2.4结论

第三章温度敏感PNIPArg载体介导的基因转染研究

3.1引言

3.2实验部分

3.2.1试剂耗材

3.2.2实验仪器

3.2.3菌体的培养与质粒的提取纯化

3.2.4 C2C12细胞的培养

3.2.5 MTT比色法

3.2.6体外转染实验

3.2.7荧光素酶(Luciferase)活性的测定

3.2.8 BCA法测总蛋白

3.2.9绿色荧光蛋白活性的测定

3.3结果与讨论

3.3.1 MTT测定载体的细胞毒性

3.3.2载体的转染效率

3.4结论

全文结论

参考文献

攻读硕士学位期间完成的学术论文

致 谢