E.coli K12木糖异构酶及木酮糖激酶基因的克隆及其在Z.mobilis CP4中的表达

摘要

以木质纤维素水解产物为原料来生产生物乙醇在能源和环保等方面具有重大的意义.构建能同时有效发酵六碳糖(葡萄糖、果糖)和五碳糖(木糖、阿拉伯糖)生产乙醇的重组运动发酵单胞菌(Z mobilis)菌株是本实验室的研发项目之一,本文工作为该项目的一部分,在运动发酵单胞菌中有效表达木糖利用必需的两个基因,即大肠杆菌木糖异构酶基因(xylA)与木酮糖激酶基因(xylB). 首先应用重叠延伸PCR技术,构建重组质粒pZB21.Peno-xylAB,使得xylAB位于Peno(Z mobilis烯醇化酶基因的启动子)下游,受Peno控制.通过电穿孔转化技术将其引入Z mobilis CP4.转化子XI与XK活性最高分别达0.239U/mg蛋白.和0.418U/mg蛋白.该结果说明在Z mobilis CP4自身启动子PenD的控制下,E.coli的xy/AB可以在Z mobils CP4中正确的转录与翻译. 应用PCR技术扩增Pgap(Z mobilis磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子),构建pBSKS-Pgap-xylAB使得xylAB位于Pgap下游,受其控制.将pBSKS-Pgap-xylAB中含有Pgap-xylAB的DNA片段分别插入两个穿梭载体pZB21与pZA22,构建重组质粒pZB21-Pgap-xylAB与pZA22-Pgap-xylAB,电穿孔转化运动发酵单胞菌.转化子的XI酶活分别为0.420、0.403U/mg蛋白,XK酶活分别为0.532、0.517U/mg蛋白.说明Pgap可以正确启动E.coB的xylAB在Z.mobilis中的转录与翻译.而载体pZB21、pZA22对xylAB的表达作用也相当,XI、XK酶活水平基本一致. Peno、Pgap都可以有效启动E.coli的xylAB在Zmobilis中的转录与翻译.酶活分析说明eno、gap基因启动子对xylAB的表达作用相当,粗酶液SDS-PAGE电泳图谱上可观察到XI、XK条带. 本工作为下一步构建利用木糖的运动发酵单胞菌工程菌菌株打下了基础.

目录

文摘

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前言

第一章文献综述

1.1木糖操纵子及xylA、xylB基因的研究

1.1.1木糖利用基因操纵子的研究

1.1.2 xylA与xylB的研究

1.2运动发酵单胞菌代谢及启动子的研究

1.3木糖异构酶、木酮糖激酶基因在运动发酵单胞菌中的表达及运动发酵单胞菌利用木糖的研究

1.4本课题的研究目的及研究内容

1.4.1研究目的

1.4.2研究内容

1.5技术路线

第二章实验材料与方法

2.1实验材料

2.1.1菌株与质粒

2.1.2主要试剂

2.1.3培养基

2.1.4质粒提取所需溶液的配制

2.1.5酶活测定用试剂的配制

2.1.6蛋白质浓度测定用试剂

2.1.7 SDS-PAGE所需试剂的配制：

2.1.8主要设备及仪器

2.2实验方法

2.2.1菌体培养

2.2.2考马斯亮蓝G-250染色测定蛋白质浓度

2.2.3 SDS—聚丙烯酰氨凝胶电泳

2.2.4木糖异构酶酶活测定

2.2.5木酮糖激酶酶活测定

2.2.6 PCR反应

2.2.7酶切反应

2.2.8 DNA琼脂糖凝胶电泳

2.2.9核酸的乙醇沉淀纯化、回收

2.2.10脱磷反应

2.2.11连接反应

2.2.12感受态细胞的制备

2.2.13重组质粒大肠杆菌感受态细胞转化与转化子的筛选

2.2.14重组质粒电穿孔转化Z.mobilis CP4和转化子的筛选

2.2.15质粒的提取

2.2.16琼脂糖凝胶电泳中DNA片段的回收

2.2.17菌落PCR筛选Z.mobilis CP4转化子

第三章实验结果与讨论

3.1 pZB21-Peno-xylAB的构建

3.1.1 pBSKS-Peno-X的构建

3.1.2pZB21-Peno-xylAB的构建

3.1.3 pZB21-Peno-xylAB电穿孔转化CP4

3.2 pZB21-Pgap-xylAB及pZA22-Pgap-xylAB的构建

3.2.1 pBGAP(pBSKS-Pgap)的构建

3.2.2 pBSKS-Pgap-xylAB的构建

3.2.3 pZB21-Pgap-xylAB及pZA22-Pgap-xylAB的构建

3.2.4 pZB21-Pgap-xylAB电穿孔转化CP4

3.2.5 pZA22-Pgap-xylAB电穿孔转化CP4

3.3酶活测定

3.3.1 CP4(pZB21-Peno-xylAB)的酶活测定

3.3.2 CP4(pZB21-Pgap-xylAB)和CP4(pZA22-Pgap-xylAB)的酶活测定

3.3.3培养时间对转化子酶活的影响

3.4 SDS-PAGE

第四章结论

4.1结论

4.2建议

符号表

参考文献

附录一文中涉及到的质粒的酶切图谱

附录二D-木酮糖标准曲线

附录三pBEI测序结果(一)

附录四pBEI测序结果(二)

附录五pBGAP测序结果

发表论文和科研情况说明

致 谢