阿维菌素生物合成基因簇两端基因的克隆及测序分析

摘要

聚酮化合物是由多种生物，如细菌、真菌、或者植物产生的一类天然产物。由于具有广泛的结构多样性和生物活性，聚酮化合物是人类医疗中最重要的一类微生物代谢产物，在临床应用中可以作为抗生素、抗癌药物、低胆固醇剂、抗寄生虫剂、抗真菌剂、杀虫剂以及免疫抑制剂等。其中作为抗寄生虫剂之一的阿维菌素是由除虫链霉菌产生的一组由8个结构相近的同系物组成的16元大环内酯类抗生素，因其极其有效的驱虫活性，已在兽医和农业领域得到广泛的应用，具有很高的研发和商业价值。然而，随着抗性病源菌的日益增多以及阿维菌素对细菌和真菌无抗菌活性的缺点，均促使对阿维菌素进一步地改进或者有其结构类似物等新化合物产生。 本实验为整个课题的前期工作。根据除虫链霉菌基因组DNA中高GC碱基含量的特点，建立并优化了PCR扩增体系和反应程序。根据GenBank数据库中提供的除虫链霉菌全基因组序列(GI：57833846)，使用Oligo 6.69软件，设计两对引物averU-A和averU-B以及averL-A和averL-B。以除虫链霉菌的染色体作为模板，扩增获得了阿维菌素生物合成基因簇上游SAV934和aveR基因之间长度为1011bp的基因，记作“averU”以及下游aveG和yerD1基因之间长度为651bp的基因，记作“averL”。分别将基因averU和avgrL与载体连接，构建了质粒pAVERU和pAVERL。类似地，以质粒pAVERU作为模板，使用引物averU1-A和averU1-B以及averU2-A和averU2-B，分别扩增获得了长度为504bp的“averU1”和长度为507bp的“averU2”两段目的基因。分别将基因averU1和averU2与载体连接，构建了质粒pAVERU1和pAVERU2。在此基础上，分别对质粒pAVERU1和pUC119_KanR使用限制酶EcoR I和Kpn I进行双酶切反应，回收目的基因片段，即小片段averU1和大片段pUC119 KanR(cut)，在T4 DNA连接酶作用下构建了重组质粒pkAVERU1；采用类似的方法，构建了重组质粒pkAVERU2。 综上，本实验圆满地完成了预期工作，为后续实验提供了操作平台，为整个课题工作奠定了良好的基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1.1聚酮类抗生素的分子生物学研究进展及组合生物合成

1.1.1聚酮类抗生素的生物合成

1.1.2聚酮类抗生素的组合生物合成

1.2阿维菌素的研究进展

1.2.1阿维菌素概述

1.2.2阿维菌素生物合成及其基因结构

1.3定向克隆

1.4同源重组

1.5质粒载体

1.6表达系统

1.7研究目的与实验策略

第二章实验材料与方法

2.1实验材料

2.1.1主要药品

2.1.2主要试剂

2.1.3主要仪器

2.1.4培养基

2.1.5菌种和质粒

2.2实验方法

2.2.1染色体DNA的提取、纯化和浓缩

2.2.2引物及PCR反应

2.2.3 DNA琼脂糖凝胶电泳

2.2A凝胶回收操作

2.2.5 DNA的酶切和连接

2.2.6感受态大肠杆菌的制备和转化

2.2.7质粒DNA的提取

2.2.8质粒纯度的测定

第三章结果与讨论

3.1 PCR反应的条件与程序优化

3.2 averU基因的扩增与载体的构建

3.2.1 averU基因的PCR扩增

3.2.2质粒pAVERU的构建

3.3 averU1基因和averU2基因的扩增与克隆

3.3.1 averU1基因和averU2基因的PCR扩增

3.3.2质粒pAVERU1和质粒pAVERU2的构建

3.4 averL基因的扩增与克隆

3.4.1 averL基因的PCR扩增

3.4.2质粒pAVERL的构建

3.5重组质粒pkAVERU1的构建

3.6重组质粒pkAVERU1的DNA鉴定

3.7重组质粒pkAVERU2的构建

3.8重组质粒pkAVERU2的DNA鉴定

第四章结论与展望

4.1主要结论

4.2展望

参考文献

附录

发表论文和参加科研情况说明

致谢