大肠杆菌双顺反子表达载体中各基因转录与表达水平的研究

摘要

从20世纪70年代初期基因克隆技术建立至今，短短几十年的时间，基因克隆技术发展十分迅猛，迄今已有很多外源基因被克隆到不同的表达载体中，进行各种研究，以期造福人类。构建多顺反子表达载体，研究原核生物多顺反子不同间隔区对外源基因表达效率的影响，将对多基因共表达具有一定的指导意义。
　　 本研究从大肠杆菌基因组序列出发，对其多顺反子间隔区多种形式和序列进行分析。实验室已有以报告基因--β-半乳糖苷酶(GAL)和绿色荧光蛋白(GFP)基因组成的双顺反子表达载体pET28a-lacZ-gfpD(无间隔序列)，pET28a-lacZgfpL(间隔序列为起始密码子与终止密码子重迭序列)，pET28a-lacZ-gfpR(β-半乳糖苷酶与绿色荧光蛋白融合表达)，pET28a-lacZ-gfg15(间隔序列为pET-32a中T7启动子后的核糖体结合序列)及pET28a-lacZ-gfp51(间隔序列为lacZ和lacY之间天然间隔区)，在此基础上，进一步构建双顺反子表达载体pET28a-lacZ'-gfpL(lacZ加入RBS序列)和pET28a-lacZ'(lacZ加入RBS序列)。将上述质粒和实验室保存的对照质粒pET28a-gfp、pET28a-lacZ和pET28a转化至大肠杆菌Tuner(DE3)中，加入IPTG进行诱导表达，分别以GFP的荧光强度衡量GFP的表达水平，以GAL的酶活力衡量GAL的表达水平，最终用蛋白质电泳进行验证。结果显示，双顺反子表达载体中不同的间隔序列不仅对位于下游的顺反子gfp的表达水平有影响，对位于上游的顺反子lacZ的表达水平可能也有一定的影响，RBS位点有利于下游的顺反子gfp的表达。同时选取pET28a-gfp为研究对象，同一IPTG诱导表达条件下，按时间梯度半定量RT-PCR测定其mRNA水平，RNA转录水平随诱导时间的延长没有明显变化。我们设计的这种双顺反子的表达规律是否适用于其他外源基因，还有待于更多的应用来证实，但至少对于双顺反子载体的构建提供了一个借鉴。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一章文献综述

1.1大肠杆菌表达系统

1.1.1 pET载体介绍及应用

1.1.2克隆宿主菌和表达宿主菌

1.2 β-半乳糖苷酶(GAL)

1.2.1 lacZ基因在基因组学中的应用

1.3绿色荧光蛋白

1.3.1 GFP的来源、结构、性质及发光机制

1.3.2 GFP的改进

1.4 mRNA水平的定量研究

1.4.1反转录作用及意义

1.4.2半定量RT-PCR技术

1.4.3荧光定量PCR技术

1.4.4实时荧光定量PCR技术的应用

1.5构建并利用双顺反子生产目的产物的研究

1.6本课题的研究目的及研究内容

1.6.1研究目的

1.6.2研究内容

1.6.3技术路线

第二章实验材料与方法

2.1实验材料

2.1.1菌株与质粒

2.1.2主要试剂

2.1.3主要仪器设备

2.1.4 PCR反应引物

2.1.5培养基及常用溶液的配制

2.2实验方法

2.2.1菌株的培养

2.2.2 E.coli感受态细胞的制备

2.2.3 PCR反应

2.2.4酶切反应

2.2.5连接反应

2.2.6质粒及连接产物转化

2.2.7阳性重组克隆的筛选与鉴定

2.2.8电泳分析

2.2.9目的条带的回收

2.2.10 E.coli质粒的小量提取(SDS-碱裂解法)

2.2.11菌体诱导培养

2.2.12绿色荧光蛋白的测定

2.2.13酶活测定

2.2.14蛋白电泳验证

2.2.15 RNA研究

第三章实验结果与讨论

3.1质粒构建

3.1.1 pET28a-lacZ'-gfpL的构建

3.1.2 pET28a-LacZ’的构建

3.2生长曲线

3.2.1不同培养基对T-28a生长曲线的影响

3.2.2诱导温度、IPTG对T-G生长曲线的影响

3.2.3 IPTG诱导分别对11个菌株生长情况的影响

3.3温度梯度诱导荧光曲线及蛋白电泳验证

3.4.菌株的评价分析

3.4.1标准曲线

3.4.2酶活及荧光值的测定

3.5 RNA水平的研究

3.5.1 RNA的提取方法的建立及结果

3.5.2总RNA中基因组DNA残留的检测

3.5.3 RNA的定量

3.5.4平台期的观测

3.5.5 gfp基因的mRNA表达水平

第四章结论

参考文献

科研情况

致谢