CTB-LK密码子多点突变及其优化基因在毕赤酵母中的表达

摘要

CTB-LK是将蚓激酶(LK)和霍乱毒素B型亚单位(CTB)通过基因融合，并在毕赤酵母中获得表达的一种新型抗血栓肠吸收蛋白，经过体外和小鼠体内实验均证明CTB-LK具有很好的预期酶活和高效肠吸收特性。
　　 为提高CTB-LK的表达量，本研究以实验室已有的CTB-LK基因为基础，在不改变所编码氨基酸的情况下，使用基因重叠延伸PCR(gene SOEing PCR)技术，对该基因中4个编码氨基酸的密码子位点进行定点突变，将4个毕赤酵母稀有密码子分别突变成毕赤酵母高频密码子。并构建了优化基因CTB-LKA的中间克隆载体pBluescript SK-CTB-LKA和毕赤酵母表达载体pPIC9k-CTB-LKA，电击转化毕赤酵母GS115，筛选获得了CTB-LKA毕赤酵母表达菌株。
　　 对CTB-LKA毕赤酵母发酵产物进行的SDS-PAGE实验表明，在45kD处出现了预期条带。在纤维平板溶栓实验中，发酵产物表现出纤维蛋白溶解酶的活性.表明CTB-LKA蛋白在毕赤酵母内得到了正确的表达和折叠。与同等体积CTB-LK毕赤酵母表达菌株发酵产物的SDS-PAGE电泳条带对比，前者在45kD处的条带更明显。通过使用纤维蛋白平板实验对CTB-LKA毕赤酵母表达菌株发酵产物溶纤活性测定结果表明，在BMGY/BMMY培养基中诱导36h后，酶活力达2450mm2/mL，比CTB-LK毕赤酵母表达菌株发酵产物酶活性提高了1.9倍。以上结果表明，经过密码子优化的CTB-LKA基因与未经过密码子优化的CTB-LK基因相比在毕赤酵母内的表达量得到了提高。

目录

文摘

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第一章绪论

1.1蚓激酶及其研究进展

1.1.1概述

1.1.2蚓激酶的生理学特征

1.1.3蚓激酶的溶栓机理

1.1.4蚓激酶的临床应用

1.1.5蚓激酶的基因工程表达研究

1.2霍乱毒素(cholera toxin，CT)及其B型亚单位(CTB)

1.3表达载体的密码子偏好性及优化

1.3.1生物密码子分析现状

1.3.2密码子偏好性

1.3.3密码子的优化

1.4毕赤酵母表达系统

1.4.1毕赤酵母表达系统的优点

1.4.2毕赤酵母表达宿主菌

1.4.3毕赤酵母表达载体

1.4.4外源蛋白在毕赤酵母中的表达

1.4.5巴斯德毕赤酵母的生物学特性

1.4.6巴氏毕赤酵母的分子生物学特性

1.4.7影响异源蛋白在巴斯德毕赤酵母中表达水平的因素

第二章对CTB-LK基因密码子的优化

2.1材料和试剂

2.1.1引物

2.1.2工具酶和试剂：

2.2实验方法

2.2.1 DNA的琼脂糖凝胶电泳

2.2.2从琼脂糖中回收DNA

2.2.3普通PCR

2.2.4重叠延伸PCR技术

2.3结果与分析

第三章毕赤酵母表达载体构建

3.1材料和试剂

3.1.1质粒、菌株和引物

3.1.2主要实验仪器

3.1.3主要试剂

3.1.4培养基

3.1.5主要溶液

3.2实验方法

3.2.1大肠杆菌感受态细胞的制备与转化

3.2.2小规模提取大肠杆菌质粒法(CTAB法)

3.2.3 DNA的限制酶消化

3.2.4 DNA的连接反应

3.2.5菌体生长量的检测

3.2.6 SDS-聚丙烯酰胺凝胶的制备

3.3结果与分析

3.3.1中间载体pBluescript SK-CTB-LKA的构建

3.3.2毕赤酵母表达CTB-LKA的载体构建

3.4实验操作过程中的遇到的一些问题

3.4.1酶切注意事项

3.4.2外源基因与表达载体的连接

3.4.3 PCR常见问题

3.5小结

第四章CTB-LKA在毕赤酵母中的表达及验证

4.2实验材料

4.2.1质粒和菌株

4.2.2主要仪器(同第二章2.1.2)

4.2.3试剂

4.2.4培养基及主要溶液

4.3实验方法

4.3.1毕赤酵母的转化

4.3.2转化子的筛选

4.3.3酵母菌落PCR筛选阳性克隆

4.3.4毕赤酵母总RNA提取

4.3.5毕赤酵母的诱导表达

4.3.6发酵上清液中蛋白的提取

4.3.7 SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳

4.3.8纤维蛋白平板检验生物活性

4.4结果讨论

4.4.1毕赤酵母的转化

4.4.2毕赤酵母的转化后G418筛选

4.4.3菌落PCR筛选效果

4.4.4纤维蛋白平板法测定外源蛋白活性

4.4.5上清液SDS-PAGE检测

第五章结论

参考文献

发表论文和科研情况说明

致谢