苹果酸脱氢酶及异柠檬酸脱氢酶扩增对E.coli产琥珀酸的影响

摘要

本文以代谢工程的理论为指导，通过对大肠杆菌代谢途径的分析，选取在厌氧条件下表达活性降低的苹果酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶，研究其在厌氧条件下对大肠杆菌琥珀酸产量的影响。通过扩增mdh和icd基因并将其分别与表达载体相连，增大苹果酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶的活性，从而提高琥珀酸产量。主要得到以下结果：
　　 通过Genbank查得苹果酸脱氢酶基因mdh和异柠檬酸脱氢酶icd的基因序列，克隆扩增编码苹果酸脱氢酶的mdh基因片段和编码异柠檬酸脱氢酶的icd基因片段；
　　 利用同源重组连接试剂盒将扩增得到的mdh基因整合到原核表达载体pET28a(+)上，构建了表达mdh基因的质粒pIFmdh；
　　 通过双酶切和连接的手段将扩增得到的icd基因与表达载体pET28a(+)相连，构建得到表达icd基因的重组质粒pIFicd；
　　 将构建得到的重组质粒pIFmdh和pIFicd转入野生型大肠杆菌W1485中，分别构建了重组菌TUC1(pIFmdh)和重组菌TUC2(pIFicd)；
　　 对TUC1和TUC2进行发酵，并通过色谱测定重组菌株琥珀酸产量。重组菌TUC1琥珀酸产率达0.22mol/mol葡萄糖，比野生型W1485提高47％；重组菌TUC2琥珀酸产率为0.195mol/mol葡萄糖，比野生型W1485提高30％。

目录

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第一章 文献综述

1.1琥珀酸的理化性质及用途

1.1.1琥珀酸的理化性质

1.1.2琥珀酸的用途

1.1.3琥珀酸衍生物的用途

1.2化学合成法生产琥珀酸

1.3生物法生产琥珀酸

1.4产琥珀酸微生物的分类

1.5主要琥珀酸产生菌代谢途径

1.5.1产琥珀酸放线杆菌

1.5.2产琥珀酸厌氧螺菌

1.6以大肠杆菌为基础的琥珀酸发酵研究的背景和优势

1.6.1大肠杆菌的代谢途径

1.6.2大肠杆菌产琥珀酸途径改造的国内外研究进展

1.7实验可行性分析

第二章 实验材料和方法

2.1实验仪器及设备

2.2实验药品及试剂的配制

2.2.1实验药品及试剂

2.2.2实验试剂的配制

2.3菌种和质粒

2.4实验方法

2.4.1菌体的培养

2.4.2大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

2.4.3质粒的提取

2.4.4大肠杆菌染色体DNA的提取

2.4.5 PCR片段的回收和纯化

2.4.6琼脂糖凝胶电泳

2.4.7琼脂糖凝胶DNA片段的回收和纯化

2.4.8目的片段的PCR扩增

2.4.9目的基因的酶切与连接

2.4.10 α互补实验

2.4.11线状质粒DNA的去磷酸化

2.4.12发酵实验操作

2.4.13内标法测定样品含量

第三章 实验结果与讨论

3.1 pET28a(+)质粒载体的提取

3.2 pIFmdh质粒的构建

3.2.1 mdh基因的PCR扩增

3.2.2质粒pIFmdh的构建

3.2.3质粒pIFmdh的检验

3.3 pIFicd质粒的构建

3.3.1 icd基因的PCR扩增

3.3.2 pIFicd质粒载体的构建

3.3.3 pIFicd质粒载体的检验

3.4重组菌株TUC1和TUC2发酵特性研究

3.4.1重组菌有氧条件下的发酵

3.4.2厌氧条件下发酵特性研究

3.5重组菌发酵产物的测定

3.5.1内标法色谱测定

3.5.2 TUC1和TUC2发酵产物的色谱检测

第四章 结论与展望

4.1结论

4.2展望

参考文献

致谢