高效乙醇发酵重组酿酒酵母菌株的构建及Sfi1p蛋白在生孢与核配过程中的功能研究

摘要

本论文包括两部分内容：第一部分涉及利用重组DNA技术、化学诱变及有性重组构建酿酒酵母乙醇发酵高效菌株；第二部分研究酿酒酵母SPB新组分蛋白Sfi1p在生孢及核配过程中的作用。
　　 由于化石能源的日益枯竭以及人们环保意识的增强，燃料乙醇生产越来越受到人们的重视。目前燃料乙醇的生产仍然主要通过酿酒酵母发酵淀粉或糖质原料来实现。如何通过提高糖－醇转化率来提高原料利用率、降低生产成本，是燃料乙醇生产中亟待解决的问题。本研究通过重组DNA技术、化学诱变和有性重组相结合的方法改造酿酒酵母工业菌株，提高了菌株在浓醪发酵条件下的发酵性能。
　　 本研究首先考察了缺失两个编码甘油－3－磷酸脱氢酶的基因GPD1和GPD2，同时过量表达编码依赖于NAD+的谷氨酸合酶的基因GLT1的酿酒酵母工业菌株S812的发酵特性。结果表明，该菌株在含2％葡萄糖的YPD培养基中发酵，乙醇产量与出发菌株相比增加17％。然而在20％葡萄糖浓度下该菌株由于不能合成起渗透平衡剂作用的甘油而表现为生长代谢缓慢。通过在发酵液中添加终浓度为30mM的甘油作为渗透压平衡剂可以在一定程度上缓解高渗透压对酵母细胞的胁迫作用，但细胞仍不能适应工业培养基中高糖浓度造成的高渗透压。
　　 为加快甘油向胞内的转运，提高菌株对高渗胁迫的抗性，使菌株更快适应浓醪发酵环境，本研究采用重组DNA技术在丧失甘油合成能力的重组酿酒酵母菌株S812中分别过量表达编码甘油/H+同向转运蛋白的基因STL1，以及对甘油主动吸收起间接作用的GUP1、GUP2基因，构建出重组菌株LE17U(STL1过量表达)，LE18U(GUP1过量表达)以及LE19U(GUP2过量表达)。发酵结果表明，在30mM甘油存在的情况下，菌株LE17U在葡萄糖浓度20％的发酵液中的生长、代谢和乙醇生产能力都较对照菌株S812U有明显提高，其中乙醇产量提高3.4％。而菌株LE18U和LE19U的发酵特征与对照菌株S812U相比没有明显改善。但是将发酵液中葡萄糖浓度提高至30％，LE17U菌株的生长、代谢及乙醇产量受到明显抑制。
　　 为了进一步改善重组菌株浓醪发酵特性，本研究采用了一种全新的方法，在二倍体菌株LE17D中缺失编码α交配因子受体的基因STE2，构建出菌株LE17DS2。将菌株LE17DS2经EMS诱变后通过有性重组实现基因组重排。由于STE2缺失，基因组重排后的单倍体细胞不能重新形成二倍体，极大的简化了筛选过程提高了筛选通量，从而筛选到单倍体菌株LS75。在30％葡萄糖浓度的浓醪发酵中发酵，菌株LS75比对照菌株LE17U的乙醇产量提高了10.88％，发酵周期缩短了10 h，而且对乙醇及高渗透压的抗性显著增强。这些研究结果证明：本研究采用的策略是一利有效的酿酒酵母乙醇发酵菌株改造方法。
　　 纺锤体极体(Spindle pole body，SPB)作为酵母细胞的微管组织中心，它在细胞分裂及细胞遗传稳定性的维持过程中起着极其重要的作用，是细胞生物学领域热门的研究课题。Sfi1p是新发现的酿酒酵母SPB蛋白组分，定位于半桥上并横跨整个半桥，对该蛋白功能及作用机制的探索，能够为高等真核细胞中同源蛋白的研究提供有用的指导。
　　 本论文利用sfi1温度敏感突变菌株探索Sfi1p在酿酒酵母减数分裂孢子形成和核配事件中的作用。分别在28℃和23℃考察携带不同类型SFI1温度敏感等位基因的菌株生孢情况。通过分析突变菌株的生孢效率和孢子组成情况，发现Sfi1p C端的温度敏感突变菌株即使在非限制性温度下，生孢效率也低于野生型菌株，并且在生孢过程中主要形成二分体孢子。通过对具有明显生孢缺陷的突变菌株的微管、前孢子膜以及细胞核进行荧光显微观察，发现Sfi1p C端突变菌株在酿酒酵母生孢过程中减数分裂Ⅱ发生异常，SPB不能正常分离，只能产生两个前孢子膜，从而产生大量的二分体孢子。这些结果首次证明Sfi1p C端在酿酒酵母的减数分裂过程中具有重要作用。
　　 通过在28℃和23℃下相应温度敏感型突变体的交配效率分析以及对交配过程中细胞核的荧光显微观察，发现部分sfi1温度敏感突变株在非限制性温度下表现出明显的杂交效率降低，即二倍体合子形成缺陷。进一步对交配过程中微管以及细胞核的荧光显微观察显示，sfi1温度敏感突变使胞质微管的功能受到影响，进而使细胞核的迁移变慢、核融合几率降低，合子产生的比例下降，影响交配效率。该结果首次揭示，Sfi1p在酿酒酵母的核配过程中具有重要作用。