新型交联酶聚体技术及其在蛋白组学与生物催化中的应用

摘要

本文针对交联酶聚体(Cross-linked enzyme aggregates，CLEAs)在制备及应用上的两类缺陷，即制备过程中沉淀步骤酶活损失大，催化大分子底物反应时传质限制严重，分别提出了糖类添加剂改善CLEAs酶活及多孔化CLEAs改性两种制备新方法，并将其应用于分析化学与生物催化领域的三个体系，即蛋白组学分析中的胰蛋白酶酶解过程、青霉素酰化酶酶法合成阿莫西林、木瓜蛋白酶酶法降解壳聚糖制活性低聚糖，具体结果如下：
　　 1.采用90％浓度乙醇为沉淀剂，0.075％戊二醛为交联剂，以传统方法制备得到了酶活收率为44％的胰蛋白酶CLEAs：胰蛋白酶CLEAs的最适催化温度(70℃)、最适催化pH(9.0)、热稳定性和储存稳定性，均较游离酶有所提高；CLEAs“脚手架”状微观形貌决定了其优良的稳定性和高催化活性。
　　 2.将胰蛋白酶CLEAs用于蛋白组学的酶解肽谱分析中，有效防止了高酶浓度下胰蛋白酶的自水解；同时结合高温辅助酶解、超声辅助酶解可实现高通量肽谱解析，分别缩短酶解时间至60min和60s，显著提高了分析通量和序列覆盖度。
　　 3.针对传统青霉素酰化酶CLEAs制备过程中沉淀步骤酶活损失大的缺陷，设计了在有机沉淀步骤加入糖类添加剂以提高最终CLEAs酶活的新技术，得到酶活收率为79.3％的青霉素酰化酶CLEAs，比传统制备工艺酶活提高30％；揭示了糖类添加剂(如海藻糖)以“水替代”方式与酶蛋白结合，起到维持酶蛋白天然结构，保持CLEAs活性的作用机理。
　　 4.将糖类添加剂改善的青霉素酰化酶CLEAs应用于抗生素阿莫西林的酶法合成反应中，考察了CLEAs对阿莫西林合成收率和选择性的影响；引入30％甲醇介质体系并在高底物比条件下反应，阿莫西林收率可达57％。
　　 5.针对传统方式制备的木瓜蛋白酶CLEAs在催化大分子底物反应时效率低的问题，提出以淀粉为致孔剂，在CLEAs内部形成孔隙结构，制成多孔化CLEAs(p-CLEAs)的改进技术；将p-CLEAs应用于大分子蛋白底物牛血清白蛋白和乳清蛋白时，酶解效率分别提高了95.9％和90.4％；证明了p-CLEAs优良的催化效果源于其多孔化的内部结构和更大的催化比表面积。
　　 6.将多孔化木瓜蛋白酶CLEAs应用于酶法降解大分子底物壳聚糖制备生物活性低聚糖反应，相同条件下还原糖释放量为游离酶催化时的85％，是传统CLEAs的4倍；采用超滤膜分离技术得到了质量分数为67.5％、相对分子量为5～10kD的具有优良抗菌性能的低聚壳聚糖产品。