人血浆中硒蛋白-P的纯化及技术开发研究

摘要

硒蛋白-P是人血浆中的一种富硒蛋白，它的硒含量大约占据了人血浆中硒含量的50％。因此，硒蛋白-P的变化对人体血浆中的硒含量影响很大。硒蛋白-P最显著的功能是作为人体内硒的运载体和具有细胞外抗氧化活性。据报道，人血浆中硒蛋白-P含量降低与克山病、白肌病、某些炎症等密切相关。因此深入研究硒蛋白-P对于这些疾病的预防和诊断意义重大。
　　为了深入研究硒蛋白-P，必须首先获得较高纯度的硒蛋白-P样品。由于硒蛋白-P在人体血浆中的含量很低，平均水平为3.04mg/L。因此，从人血浆中分离纯化硒蛋白-P对纯化方法的特异性要求较高。已报道的获取纯度较高的人血浆中硒蛋白-P的有效方法是免疫亲和色谱法，该方法的关键是得到能够产生硒蛋白-P单克隆抗体的硒蛋白-P样品。但是目前仅有的报道，采用四步色谱法从人血浆中获得了能够产生硒蛋白-P单克隆抗体的硒蛋白-P样品，步骤繁琐，回收率仅为4～8%。并且现在也没有市售的硒蛋白-P单克隆抗体样品，免疫亲和色谱法的应用受到限制。本研究的目的就是开发一种有效的获取硒蛋白-P样品的方法，为硒蛋白-P单克隆抗体的制备提供足够的原材料。
　　本课题开发建立了一种简单、高效获取硒蛋白-P样品的方法。采用两步连续亲和色谱法：肝素-琼脂糖凝胶和Ni-琼脂糖凝胶色谱从人血浆中纯化硒蛋白-P。考察了国产色谱填料和美国GE填料对硒蛋白-P的亲和活性，最终选择了亲和活力较高的GE填料。完成了色谱梯度洗脱中最佳流动相洗脱梯度的设置，最终建立了两步亲和色谱法纯化人血浆中硒蛋白-P的方法。引入氢化物发生-原子荧光分光光度法检测硒含量，作为色谱过程中硒蛋白-P的检测手段，跟踪色谱纯化过程，并完成该检测方法的方法学考察，此方法灵敏度较高，方法准确。选用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对色谱纯化得到的硒蛋白-P样品进行定性和纯度检测，验证得到了一定纯度的硒蛋白-P样品。最后对色谱纯化后得到的硒蛋白-P样品进行超滤、冷冻干燥等后处理最终得到了硒蛋白-P固体样品。
　　本课题建立了完整的人血浆中硒蛋白-P的纯化、检测、后处理的方法，最终得到了一定纯度的硒蛋白-P固体样品。解决了目前获取制备硒蛋白-P单克隆抗体的样品较为困难的问题，为采用免疫亲和色谱法获取高纯度的硒蛋白-P奠定了基础，在推动硒蛋白-P深入研究方面具有重要的意义。

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第一章 文献综述

1.1 制备色谱技术的研究

1.2 蛋白质的纯化技术研究

1.3硒的检测技术研究

1.4硒蛋白的研究

1.5硒蛋白-P的研究进展

1.6 本论文的研究工作

第二章 亲和色谱法纯化血浆中的硒蛋白-P技术研究

2.1 引言

2.2 亲和色谱纯化硒蛋白-P原理

2.3 试剂材料和仪器

2.4 亲和色谱纯化技术的研究

2.5 本章小结

第三章 氢化物发生-原子荧光分光光度法检测硒技术研究

3.1 引言

3.2 实验原理

3.3 实验试剂和仪器

3.4实验所需溶液的配置

3.5 硒的检测

3.6硒的检测方法学考察

3.7 本章小结

第四章 聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测蛋白技术研究

4.1 引言

4.2 SDS-PAGE实验原理

4.3实验试剂和仪器

4.4 电泳缓冲液的配置

4.5 实验步骤

4.6 电泳结果分析

4.7 本章小结

第五章 蛋白样品的后处理技术研究

5.1 引言

5.2 实验原理

5.3实验仪器

5.4 实验步骤及结果分析

5.5 本章小结

第六章 结论与展望

6.1 结论

6.2 展望

参考文献

发表论文和科研情况说明

致谢