金橙黄微小杆菌产碱性蛋白酶发酵条件优化及酶学性质研究

摘要

本研究室以往从腐败的碱性硅溶胶中分离出一株金橙黄微小杆菌EX0。本研究对该菌株产生碱性蛋白酶的能力、产酶条件、及其酶学性质进行了研究,为探索新的碱性蛋白酶来源及其产业化应用提供了依据。
　　利用酪蛋白培养基进行筛选,发现该菌株有水解酪蛋白的能力,表明其有产生蛋白酶的能力,产量为13.361U/mL。之后采用了单因素试验和正交实验的方法,对金橙黄微小杆菌产碱性蛋白酶条件进行优化,以及福林法测定不同条件下碱性蛋白酶活力。实验结果显示培养基最佳组成成分为酵母膏10g/L,玉米粉10g/L，NaCl5g/L,最优发酵条件为碳氮比为1:1,温度为25℃,培养时间21h,最佳接种量为8％,最佳培养基初始pH为8.8。优化后其产酶量能够达到37.793U/mL。
　　该实验利用不同饱和度的硫酸铵进行沉淀,得到最佳的硫酸铵饱和度为50%。将浓缩后的酶液通过葡聚糖凝胶层析,经分离纯化后,金橙黄微小杆菌分泌的碱性蛋白酶分子量大小约42KDa,不同浓度的EDTA和β-巯基乙醇均对该蛋白酶有不同程度的抑制作用,EDTA对蛋白酶的抑制作用,说明该酶可能含有金属离子。该酶反应的最适温度为50℃,反应的最适pH为8.0。金属离子如Cu2+、Zn2+、Mn2+,对酶活性表现出强烈抑制作用,Mg2+对酶表现出一定的激活作用。
　　近年来对碱性蛋白酶的研究主要来源于地衣芽胞杆菌、枯草芽孢杆菌等芽孢杆菌属,对于其他种属的微生物是否能够产生具有工业价值的碱性蛋白酶还有待进一步探索。腐败的碱性硅溶胶中营养成分不高,且属于高 pH环境,金橙黄微小杆菌能够在低营养的环境下大量生长,该菌具有易培养的特点。实验结果证明,金橙黄微小杆菌能够产生碱性蛋白酶,且于24h达到最高值,因此为探索是否能够利用基因工程和酶工程等技术手段获得高效表达的碱性蛋白酶奠定了基础,以及利用蛋白质工程手段定向对表达酶基因进行改造,以获得人类所需要的酶提供了理论基础。

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第一章 文献综述

1.1 引言

1.2 蛋白酶的分类

1.3 嗜碱性微生物

1.4 碱性蛋白酶的分布及来源

1.5 碱性蛋白酶性质

1.6 碱性蛋白酶功能与用途

1.7 蛋白酶的生产

1.8 选题的目的与意义

第二章 金橙黄微小杆菌碱性蛋白酶发酵条件优化

2.1实验材料

2.2 实验方法

2.3 实验结果与分析

2.4 小结

第三章 金橙黄微小杆菌产碱性蛋白酶培养基筛选

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 实验结果与分析

3.4 小结

第四章 金橙黄微小杆菌碱性蛋白酶分离纯化及酶学特性

4.1 材料与试剂

4.2 实验方法[71-74]

4.3 实验结果

4.4 分析与讨论

4.5 小结

第五章 碱性蛋白酶基因克隆

5.1实验材料

5.2 实验方法[76-81]

5.3 实验结果

5.4 小结

第六章 结论与展望

参考文献

发表论文和科研情况说明

致谢