粘连分子Paraxial Protocadherin在非洲爪蟾耳基板发育中的功能研究

摘要

脊椎动物的内耳是听觉的主要功能性器官。在内耳发育过程中，最早出现的形态上可见的结构是位于胚胎两侧预定后脑和预定表皮旁的一个增厚的外胚层细胞区域，即耳基板。耳基板随后内陷形成一个耳杯，然后它从胚胎表皮脱落形成一个囊泡状结构称为听泡。听泡细胞经历了一段强烈的增殖和复杂的细胞分化及形态发生时期，最终分化形成内耳的各种细胞。在各种脊椎动物中，已经证明多种信号分子和多个转录调控因子等都与内耳的特化和图式建成有关。但是，还有许多发育的具体机制目前还不是很清楚。 本论文报道了一个粘连分子cadherin家族的成员ParaxialProtocadherin(PAPC)对于非洲爪蟾听泡的形成是必需的。原位杂交结果表明，在肉眼可见的耳基板出现以前，PAPC已经特异性地在耳基板的前体细胞中表达。在随后的内耳发育过程中PAPC持续特异性地表达在耳杯，听泡等内耳细胞中。PAPC的这种表达图式强烈提示PAPC可能参与爪蟾内耳的早期发育过程。同时，利用显性失活质粒DN-PAPC或M-PAPC竞争性地抑制PAPC的功能可导致听泡结构的缺失和早期内耳特异性标志基因Sox9和Tbx2的表达缺失，而且这一表型能够被FL-PAPC共注射所拯救回复正常。这些结果都提示PAPC分子对于爪蟾胚胎早期的听泡的形态发生和细胞特化是必需的。同时，研究发现PAPC异位注射并不足以诱导一个新的异源的耳基板的形成。 为了进一步研究PAPC的蛋白水平的表达及其生物学功能，需要制备PAPC的抗体，但至今没有商业化的PAPC抗体，其他文献也未见相关报道。为此我们应用GST表达系统表达融合蛋白PAPC-GST。然后用常规方法免疫新西兰大白兔，获得PAPC多克隆抗体。Westernblot分析发现，以1：3000稀释的该多克隆抗体为一抗时，可以在转染了全长PAPC(FL-PAPC)质粒的HEK293T细胞的蛋白抽提物中杂交出特异的印迹条带，PAPC蛋白可以竞争性抑制该抗体对FL-PAPC质粒转染细胞的蛋白抽提物的特异性条带。用1：500稀释的该抗体为一抗进行免疫荧光分析，发现PAPC多克隆抗体能够识别在爪蟾动物极中过表达的PAPC蛋白，而且其荧光信号是定位在细胞膜上，这更进一步说明了该多克隆抗体的专一性。有关PAPC抗体对爪蟾胚胎发育中的内源的蛋白的识别实验正在进行中。 这项工作第一次证明粘连分子PAPC对于爪蟾听泡的形成是必需的，为进一步研究内耳的发育过程中细胞迁移和细胞命运决定的分子机制提供了很大的空间。

目录

缩写简表

1 引言

2 实验材料和方法

3 实验结果

3.1PAPC在耳基板发育过程中的表达

3.2PAPC多克隆抗体的制备与检测

3.3抑制PAPC功能破坏听泡的形成

3.4PAPC功能的缺失抑制了听泡特异性基因的表达

3.5异位表达PAPC并不足以诱导一个新的耳基板的形成

4 讨论

5 致谢

6 参考文献

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