人的类RecD解旋酶Pif1通过抑制端粒酶活性调控端粒延伸

摘要

端粒是真核生物线状染色体的末端结构，由端粒DNA和其结合蛋白组成。它在维持基因组的稳定、防止染色体DNA末端融合和降解中起着重要的作用，并与癌症、衰老密切相关。端粒DNA重复序列的延伸是由特化的反转录酶即端粒酶完成的。端粒酶的核心组分是由具有催化活性的蛋白质亚基(hTERT)和RNA亚基(hTR)组成，hTR为合成端粒DNA重复序列提供模板。 以前的研究发现芽殖酵母Pif1解旋酶通过抑制端粒酶途径来抑制端粒DNA的加长。端粒DNA复制的基本机制从酵母到人都高度保守，而类Pif1基因在多种生物中都广泛存在。因而，本研究的主要目的是鉴定人Pif1蛋白，是否也参与了端粒DNA的复制和维持。本工作首先克隆了人Pif1的cDNA。一级结构及生化分析表明，人Pif1蛋白是大肠杆菌RecD潜在的同源蛋白；具有依赖于ATP的5'至3'的DNA解旋酶活性。在端粒酶阳性的HT1080细胞中过表达野生型hPif1蛋白可导致细胞端粒DNA缩短，抑制hPif1过表达可使端粒DNA长度恢复。人Pif1对端粒DNA长度的影响需要其ATPase/解旋酶活性，因为丧失ATPase/解旋酶活性的突变体过表达不影响端粒DNA的长度。在端粒酶阴性的GM487细胞中过表达hPif1不影响端粒变化，提示hPif1蛋白对端粒DNA的效应是通过端粒酶通路介导的。体外生化实验还显示，重组Pif1蛋白可通过降低端粒酶的进行性从而直接抑制端粒酶的活性，而且，hPif1解旋酶能够解开DNA/RNA杂合双螺旋。染色质免疫沉淀还证实hPif1结合在端粒DNA上。基于这些实验结果，我们推测hPif1通过把端粒酶RNA从端粒DNA上解离下来而抑制端粒酶介导端粒DNA的加长。类RecD解旋酶在生物进化过程中已获得新功能。

目录

摘 要

英文缩写

图表目录

一、引 言

1.端粒和端粒酶的研究历史

2.端粒结合蛋白与端粒长度调控

3.端粒酶及其活性调控

4.解旋酶与端粒复制调控

5.Pif1解旋酶亚家族

二、材料与方法

三、结 果

1.人Pif1全长cDNA的克隆

2.人Pif1蛋白是一种的大肠杆菌RecD同源蛋白

3.人Pif1蛋白的四种多克隆抗体的制备

4.人Pif1基因在端粒酶阳性细胞株中表达，但在端粒酶阴性细胞无表达

5.人Pif1蛋白具有5’至3’的DNA解旋酶活性

6.细胞中Pif1蛋白水平受泛素介导的蛋白质降解系统调控

7.过表达hPif1不影响细胞的生长

8.过表达有ATP酶/解旋酶活性的hPif1导致端粒的缩短

9.抑制hPif1的表达可恢复端粒的长度

10.hPif1在体内通过抑制端粒酶通路抑制端粒的延伸

11.hPif1在体外抑制端粒酶的活性

12.人Pif1蛋白在体外降低端粒酶的进行性(与周波合作的工作)

13.人Pif1蛋白具有RNA/DNA解旋酶活性

14.在体内和体外，hPif1蛋白与端粒DNA结合

四、讨 论

五、参考文献

六、发表研究论文

七、在读期间申请的专利

八、参加国内国际会议

九、获 奖

十、致谢