肺炎克雷伯氏菌产2,3-丁二醇的代谢调控研究

摘要

2,3-丁二醇（2,3-butanediol，2,3-BD）是一种非常重要的平台化合物和液体燃料，其被广泛应用于化工、燃料、食品以及航空航天等多个领域。肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）以其广泛的底物利用能力、较高的生产效率而被认为是最具有工业化潜力的2,3-BD生产菌种之一。但是该菌株在进行2,3-BD发酵时会产生多种代谢副产物，如：乙酸、乳酸和乙醇等物质，这些副产物在一定程度上降低了2,3-BD的产量，并且也影响了2,3-BD的后提取与纯化，增加了下游处理的难度和生产成本。目前关于K. pneumoniae代谢改造还鲜有报道，因此研究调控2,3-BD及主要副产物的代谢途径极为重要，将为提高2,3-BD的产量提供重要的理论支持。本论文主要包括以下几个方面的工作：
　　（1）在K.pneumoniae菌株中成功实现了乙酰乳酸脱羧酶、乙酰乳酸合成酶和乙偶姻还原酶单独、两两和三者同时过表达。基因工程菌发酵性能实验表明，同时过表达乙酰乳酸合成酶和乙偶姻还原酶的工程菌KG-rs能够较显著提高2,3-BD的产量。KG-rs菌株胞内较高的酶活和NADH供应可能是菌株2,3-BD产量提高的原因。同时对菌株利用5种碳源发酵产2,3-BD进行了比较，除乳糖外，KG-rs在葡萄糖、蔗糖、果糖和半乳糖为唯一碳源的培养基上都表现出来较高的2,3-BD产量和转化效率。
　　（2）分别构建了乳酸脱氢酶基因缺失、乙醇脱氢酶基因缺失和磷酸转乙酰基酶基因缺失的基因工程菌株K.pneumoniae△ldhA、△adhE和△pta。发酵数据显示△adhE和△pta2,3-BD产量分别提高了33.65％和19.58%；△ldhA生长速度加快，但是2,3-BD产量提高幅度不大。从菌株生长性能、酶活性、胞内NADH和NAD+浓度和代谢流等参数解释了△ldhA、△adhE和△pta发酵性能差异的原因。
　　（3）△ldhA、△adhE和△pta在以葡萄糖、果糖和半乳糖为唯一碳源的培养基发酵时，2,3-BD的产量和生产效率都有所提高。但是，它们在以乳糖为唯一碳源的培养基上发酵时，2,3-BD的产量和乳糖消耗速度都降低了。酶活检测数据表明，基因缺失菌株中乳糖酶和乳糖通透酶的酶活降低了，这部分解释了为什么△ldhA、△adhE和△pta利用乳糖发酵效率降低。

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第一章 文献综述

1.1 生物基化学品概述

1.2 2,3-BD概况

1.3 2,3-BD的生产方法

1.4 微生物合成2,3-BD的代谢途径

1.5 代谢副产物与中间产物

1.6 高产2,3-BD研究进展

1.7 代谢流量分析

1.8 本论文的立题依据与研究内容

第二章 过表达 2,3-丁二醇合成途径关键酶基因对 K. pneumoniae发酵生产 2,3-丁二醇的影响

2.1引言

2.2 实验材料与仪器

2.3 实验方法

2.4 实验结果与讨论

2.5 本章小节

第三章 敲除副产物合成途径关键酶基因对 K. pneumoniae发酵生产 2,3-丁二醇的影响

3.1 引言

3.2 实验材料与仪器

3.3 实验方法

3.4 实验结果与讨论

3.5 本章小节

第四章 结论与展望

4.1 结论

4.2 本文创新点

4.3 展望

参考文献

博士在学期间发表论文及参加科研情况说明

附录

致谢