EAP2的双稳态表达主控白念珠菌白-灰形态的转换

摘要

白念珠菌(Candida albicans)是一种人类常见的机会致病真菌，常导致免疫系统受损的人群粘膜表面或系统感染。白念珠菌至少有七种不同形态，不同形态的菌落之间可以高频率的相互转换，不同形态之间转换能力与白念珠菌致病能力密切相关。其中研究较多的是酵母形态-菌丝形态和白菌-灰菌形态转换。
　　 特定条件下酿酒酵母能进行侵入生长和丝状生长，其调控机制已研究的比较清楚。为了研究白念珠菌形态转换的调控是否也存在类似的机制，我们利用酿酒酵母单倍体flo8缺失株，通过功能互补的方法筛选白念珠菌基因组文库，以获得白念珠菌形态发生相关的基因。我们筛选得到EAP2和CZF2等多个基因，EAP2和CZF2都能校正flo8缺失株侵入生长缺陷。EAP2基因编码一个785个氨基酸的蛋白。氨基酸序列分析表明，Eap2的N端含有一个真菌特异性的Tos9结构域，其主要特征是包括一个非常保守的序列模式(64KRWTDG69)，是一个可能的PKA磷酸化位点。Eap2蛋白N-端有一个核定位信号序列，GFP-Eap2融合表达发现，Eap2定位于细胞核内。CZF2编码一个624个氨基酸的蛋白，属于Gal4蛋白家族，其N-端含有一保守的C6型锌指结构Zn2Cys6DNA结合结构域。
　　 保守的MAPK途径和cAMP/PKA信号转导途径均参与了酿酒酵母和白念珠菌形态发生的调控，利用酿酒酵母缺失株，我们分析了Eap2和Czf2的功能。在酿酒酵母双倍体缺失株中，Eap2和Czf2都能校正ste12,ste7,tec1和flo8在氮源缺乏条件下菌丝生长的缺陷。在酿酒酵母单倍体缺失株中，Eap2和Czf2能校正ste12，ste7,tec1和flo8在碳源缺乏条件下侵入生长的缺陷。说明Eap2和Czf2在酿酒酵母菌丝生长和侵入生长中的激活作用绕过了MAPK途径和Flo8因子的需求。
　　 Northern杂交分析表明，EAP2基因有两个大小不同的转录本，分别为～2.5 kb和～3.9 kb。在WO-1灰菌细胞中EAP2两个转录本都能表达，而在WO-1白菌细胞中则检测不到明显的表达条带。因此，在白灰转换中EAP2呈现一种“全或无(all-or-none)”的双稳态表达模式。该结果暗示Eap2可能参与白念珠菌白-灰形态转换的调控。
　　 为了进一步研究Eap2在白念珠菌中的功能，我们构建了eap2/eap2缺失株。在MTL纯合型菌株中，EAP2基因的敲除阻挡了白菌向灰菌的转换。将pACT1-EAP2导回缺失株，细胞重新获得了白-灰形态转换的能力。说明EAP2是白-灰形态转换所必需的基因。MTL基因座不仅调控白-灰形态转换，还调控白念珠菌交配过程。我们发现EAP2基因的敲除并没有阻挡白念珠菌交配的进行，但是与野生型相比，交配效率明显降低。
　　 在白念珠菌MTL纯合型菌株中过表达EAP2基因，细胞就锁定在灰菌状态。不管在30℃还是37℃培养EAP2基因过表达菌株，细胞仍然保持在灰菌状态。白念珠菌MTL杂合型菌株中没有白-灰转换现象，细胞锁定为白菌状态。我们发现过表达EAP2促进了MTL杂合型白菌向灰菌转换。因此，过表达EAP2能够战胜MTLa/α复合体对白菌向灰菌转换的抑制作用。
　　 白念珠菌的白-灰转换是一种双稳态转换。白菌细胞一旦转换为灰菌细胞，即能稳定地传递数代；相反亦然。本研究中我们发现，EAP2敲除阻断了灰菌形成，在MTLa或MTLα钝合型菌株中用ACT1启动子过表达EAP2将细胞锁定为灰菌状态，而在eap2缺失株中过表达EAP2却不能稳定于灰菌状态，说明ACT1启动子过表达EAP2激活了内源EAP2基因的表达，EAP2内源高表达是维持灰菌状态所必需的。另外，在白念珠菌中EAP2的表达呈现为一种“全或无”的模式。因此，我们认为EAP2双稳态表达调控可能通过一种反馈调控机制进行。
　　 我们检测了EAP2基因在MTL杂合型白念珠菌多种缺失株中的表达情况。Northern杂交表明，在酵母形态和菌丝形态生长条件下，tup1和efg1缺失株中大小两个转录本都有表达。nrg1缺失株中只有EAP2小的转录本表达。尽管EAP2基因在野生型白念珠菌SC5314酵母形态和菌丝形态细胞中都检测不到表达，但在tup1、nrg1和efg1等缺失株中的表达提示EAP2的转录受Tup1，Nrg1，Efg1等因子的抑制，而且Eap2可能参与酵母形态-菌丝形态转变的调控。
　　 EAP2过表达抑制了白念珠菌MTL纯合型细胞的菌丝形成。在MTL杂合型白菌细胞中，EAP2过表达也能部分抑制菌丝的形成；灰菌细胞中则完全抑制菌丝的形成。在杂合型eap2敲除株中，ACT1启动子下表达的EAP2，不能使细胞稳定保持在灰菌状态，但是也不能形成菌丝，说明Eap2不仅参与白-灰转换的调控，还参与菌丝生长的调控。
　　 Tos9结构域的主要特征是含有一个保守的潜在PKA磷酸化位点(64KRWTDG69)。在EMTL纯合型菌株中，Tos9结构域的缺失抵消了Eap2促进白茵向灰菌转换的功能也解除了Eap2抑制菌丝生长的功能。为了进一步了解Tos9结构域的功能作用，我们将PKA磷酸化位点67位的苏氨酸(T)突变为丙氨酸(A)。T67A突变同样消除了Eap2促进白菌向灰菌转换及其抑制菌丝生长的功能。说明PKA磷酸化位点(64KRWTDG69)对Eap2的功能非常重要，Eap2可能作用于cAMP/PKA途径的下游。
　　 Czf2是一个包括Zn(Ⅱ)2Cys6锌指结构的转录因子。与MTL杂合型野生型白念珠菌相比，CZF2在efg1，nrg1和tec1等突变株中表达量大大提高。为了研究Czf2在白色念珠菌形态发生中的功能作用，我们构建了白念珠菌czf2缺失株。在液体含血清的培养基中，CZF2基因双拷贝缺失株能够诱导形成较好的菌丝。在含有血清的琼脂糖固体培养基上，与野生型菌株相比，czf2双拷贝缺失株只能形成分枝较少而且粗的丝状菌落。在MTL纯合型菌株中CZF2基因双拷贝敲除提高了白菌到灰菌转换的效率，说明Czf2抑制了白念珠菌从白菌到灰菌的转换。交配试验发现，与野生型相比，czf2缺失株的交配效率有所提高。

目录

文摘

英文文摘

声明

引 言

材料和方法(Materials and Methods)

1实验材料

2实验方法

结果与讨论

第一章EAP2的克隆及其在酿酒酵母中的功能研究

第二章EAP2的双稳态表达主控白念珠菌白-灰形态转换

第三章Eap2亚细胞定位及Tos9结构域的功能分析

第四章Eap2在白念珠菌菌丝生长中的功能作用

第五章Czf2在白念珠菌白-灰转换中的功能研究

总 结

参考文献

在学期间发表论文

致谢