产油微藻的筛选及其培养过程优化研究

摘要

化石燃料使用所带来的经济及环境问题促使各国开始寻求生物能源作为替代品。但考虑到耕地、水资源及其他环境影响，传统生物能源(生物乙醇及生物柴油为主)并不适合作为化石能源替代品。相比之下，微藻对环境的适应性及其高生长速率和油脂含量使得其可为生物柴油的生产提供稳定的原料。
　　在本研究中，我们从自然界分离出31株天然藻株。筛选发现，海洋微藻Q6的生物量及粗油脂产率(30.56±0.87、5.82±0.50 mg·L-1)均高于其他藻株；后经鉴定为微绿球藻Nannochloropsis gaditana。考虑到海洋微藻在水资源利用上的优势，我们认为N.gaditana Q6具有研究前景，因而将对其进行深入研究。
　　就大量元素而言，NH4HCO3和NaH2PO4分别为N.gaditana Q6的最适氮源及磷源。其中，NH4HCO3在促进生物量积累的同时会对油脂积累产生一定抑制，且440μMNH4HCO3最利于生物量的积累。与NH4HCO3相反，而NaH2PO4对生物量和油脂积累过程的影响在一定程度上同步，即在促进/抑制生物量积累的同时会对油脂积累产生类似效应。营养方式也对N.gaditana Q6有显著影响效应；相较于自养及兼性异养，异养条件下N.gaditana Q6的生长及油脂产率严重降低。不过，营养方式的影响也受所加碳源的左右。作为最适碳源，NaHCO3可有效促进N. gaditana Q6在自养条件下的生物量积累，但其所引发的絮凝会对采收及后续加工产生负面影响。而作为兼性异养条件下的最佳碳源，甘油在单因素实验中对生物量和油脂积累的促进作用极为有限，而其对光合作用及胁迫效应的负面影响导致其在统计实验中严重阻碍了N.gaditana Q6的生物量和油脂积累过程。因此，无外加碳源的自养生长系N.gaditana Q6的最佳营养模式。
　　在本研究所考察的微量元素(Mo、Zn、Cu、Co、Mn、Fe)中，仅Fe和Mn系N.gaditana Q6培养所必需。本研究表明，适当的Fe(11.7μM)和Mn(0.09-9.10μM)均可有效促进生物量的积累。但是，Fe对N.gaditana Q6的重要性要高于Mn。单因素实验表明，11.7μM作为起始Fe浓度阈值，可有效促进胞内胁迫效应及油脂积累；而这一效应可能源于培养前期Fe对氮吸收的促进作用。另一方面，油脂积累所对应的最佳起始Mn浓度从第2天的<0.09μM上升至第6天后的0.91μM；同时，Mn浓度的变化对胁迫效应无显著影响。统计实验则进一步发现，Fe系作为唯一可影响整个N.gaditana Q6生物量变化过程的因素，且11.7μM Fe可有效促进生物量的增加。
　　盐度、接种量、pH值及照度等环境因素均对N.gaditana Q6有显著影响，但其具体作用不尽相同。盐度对N.gaditana Q6的培养有显著的促进，且其最大生物量(571.91±18.26 mg·L-1)、油脂含量(18.03±0.69％)及其浓度(105.60±0.77 mg·L-1)均对应于海水培养基(盐度32.10‰)。就照度而言，5000 Lux系N.gaditana Q6光合作用的最佳照度，但其对营养吸收的促进作用使得1500 Lux所得最终生物量最高；另一方面，7500 Lux对营养吸收及光合作用的抑制使得其在抑制生物量增长的同时有助于油脂积累。接种量对生物量积累过程的影响局限于培养早期，但在单因素实验中20 mg·L-1所得油脂含量最高。不过，统计实验研究发现 N.gaditanaQ6对照度和接种量的变化有一定的承受弹性。此外，NaOH对N.gaditana Q6的影响主要受微藻生长及营养吸收所引发的培养基碱性化所左右；这一情况表现为单因素实验中最高油脂含量在所对应最优NaOH起始浓度从第10天的100μM降至第12天的50μM，而统计实验则表明NaOH从第12天开始对生物量及油脂积累过程有显著的负面效应。
　　统计实验进一步表明，N.gaditana Q6的油脂产量主要受生物量积累过程而非单细胞油脂积累的影响。这表明在N.gaditana Q6的培养过程中，NH4HCO3、MnCl2和FeCl3的起始浓度应保持一定的浓度水平(440、9.10、11.7μM)，而NaH2PO4和NaOH则维持相对较低的起始浓度(24、50μM)。同时考虑到Fe与氮之间的关系，持续性氮源投入可能是有效促进N.gaditana Q6生物量及油脂积累的途径之一。

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第一章 研究背景

1.1 前言

1.2 生物能源

1.3 微藻生物能源

1.4 微藻生物柴油研究现状

1.5 本论文的研究目的、意义和主要内容

第二章 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

第三章 微藻的分离纯化筛选与鉴定

3.1 分离纯化

3.2 筛选

3.3 藻株鉴定

3.4 本章小结

第四章 生物量及油脂定量方法确立

4.1 生物量定量方法

4.2 油脂定量方法

4.3 本章小结

第五章 大量元素对N. gaditana Q6的影响

5.1 磷

5.2 氮

5.3 碳

5.4 RSM-CCD

5.5 本章小结

第六章 微量元素对N. gaditana Q6的影响

6.1 微量元素缺失的影响

6.2 Fe对N. gaditana Q6的影响

6.3 Mn对N. gaditana Q6的影响

6.4 本章小结

第七章 其他条件对N. gaditana Q6的影响

7.1 盐度

7.2 接种量

7.3 pH

7.4 照度

7.5 本章小结

第八章 统计学实验

8.1 实验设计

8.2 实验结果及其分析

8.3 本章小结

第九章 结论与展望

9.1 结论

9.2 展望

9.3 创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

致谢