Vpx/Vpr劫持CRL4(DCAF1)E3泛素连接酶拮抗宿主因子的作用机制

摘要

Vpx蛋白及其同源蛋白Vpr是被不同的慢病毒HIV/SIV所编码的辅助蛋白。为了促进病毒的复制，Vpx演变成能够诱导SAMHD1降解而Vpr能够诱导HLTF降解。Vpx和Vpr都能够募集CRL4（DCAF1）E3泛素连接酶行使降解宿主限制因子的功能，选择性破坏这种病毒CRL4（DCAF1）E3复合体的形成将会是一种有效的抗病毒策略。 近年来，我们课题组已经发现细胞内 Cullin4蛋白翻译后的修饰作用Neddylations是激活病毒CRL4（DCAF1）E3复合体所必需的过程，同时发现了一种抗肿瘤的抑制剂MLN4924能够有效的阻断Vpx-CRL4（DCAF1）E3复合物中的DCAF1翻译后的修饰作用，进而阻断了Vpx诱导的SAMHD1蛋白的降解以及Vpx依赖的猕猴猴免疫缺陷病毒（macaque simian immunodeficiency virus， SIVmac）和HIV-1病毒在巨噬细胞内的复制。尽管如此，人们仍然对Vpx/Vpr-CRL4(DCAF1) E3泛素复合物的组装机制的了解甚少。 在本文章中，我们阐明了辅助蛋白Vpx/Vpr的CRL4（DCAF1）E3复合体的组装都需要一个高度保守的重要功能区锌指功能区，该功能区对 Vpx/r结合细胞因子DCAF1所必需但并不影响Vpx/r与其底物的结合。在该保守锌指功能区内的碱基对Vpx/r形成CRL4（DCAF1）E3复合体至关重要，同时也是其降解宿主因子SAMHD1或HLTF蛋白所必需的。 更为重要的是应用锌离子螯合剂 N,N,N,N-tetrakis-(2-pyridylmethyl) ethylenediamine（ TPEN）改变细胞内的锌离子浓度能够阻断 Vpx诱导的SAMHD1的降解以及Vpx依赖的SIVmac病毒在巨噬细胞内的复制。TPEN选择性的抑制Vpx与DCAF1结合但不破坏Vpx结合SAMHD1及Vpx包装进入病毒。同时我们也证实了锌离子的结合对HIV-1 Vpr-CRL4 E3连接酶的组装也是非常重要的。另外，Vpr锌指功能区的突变或TPEN处理能够有效的抑制Vpr-CRL4 E3连接酶复合体的组装、阻碍Vpr对HLTF的降解作用及Vpr引起的细胞G2周期阻滞作用。 综上所述，我们揭示了Vpx和Vpr招募宿主CRL4（DCAF1）E3连接酶复合体所需要的保守策略，这将为一个全新的抗人类免疫缺陷病毒的药物研发提供重要靶点。

目录

声明

前言

中英缩略词表

第一章 绪论

1.1. 研究背景

1.1.1 人类免疫缺陷病毒与艾滋病流行现状

1.1.2 病毒辅助因子与宿主限制因子相互作用的研究现状

1.1.3CUL4A–DDB1 (DCAF1) E3泛素连接酶

1.1.4 病毒因子Vpx蛋白研究进展

1.1.5 SAMHD1蛋白研究现状

1.1.6 Vpr蛋白功能的研究进展

1.1.7 HLTF蛋白研究进展

1.1.8 锌离子及锌离子螯合剂TPEN

1.2 主要研究内容及重要意义

第二章 材料与方法

2.1. 实验材料、试剂与仪器

2.1.1.感受态细胞株和细胞系

2.1.2.质粒构建

2.1.3 抗体

2.1.4 主要化学试剂

2.1.5 引物合成和测序

2.1.6 主要仪器

2.2 实验方法

2.2.2 一般PCR反应

2.2.3 氨基酸定点突变PCR反应

2.2.4 DNA凝胶回收

2.2.5 T4酶连接反应

2.2.6 试剂盒法提取质粒DNA（以无内毒素小提质粒为例）

2.2.7 真核细胞培养

2.2.8HEK 293T贴壁细胞Lipo2000转染法（以12孔板为例）

2.2.9 收集分泌的病毒及检测方法

2.2.10 带有HA/Flag标签蛋白的免疫共沉淀实验

2.2.11蛋白质免疫印迹法及其定量分析（Western Blot）

2.2.12 细胞毒性分析

2.2.13 流式细胞分析仪检测G2周期阻滞

2.2.14 细胞核与细胞质分离实验（12孔板为例）

2.2.15 蛋白结构模型模拟

2.2.16 数据分析

第三章 结果与讨论

3.1. 病毒蛋白 Vpx 锌结合功能区在其拮抗宿主限制因子SAMHD1中的作用机制

3.1.1.锌结合功能区在HIV/SIV Vpx蛋白进化过程中是高度保守的

3.1.2.锌离子结合区对Vpx降解人源SAMHD1蛋白的功能至关重要

3.1.3.锌离子结合功能区对 Vpxmac 蛋白拮抗宿主限制因子SAMHD1 促进慢病毒 SIVmac 在单核巨噬细胞内的复制能力具有重要作用

3.1.4.锌离子结合功能区影响Vpx功能的作用机制研究

3.1.5.实验结果讨论

3.1.6.小结

3.2. 锌离子螯合剂TPEN抑制Vpx功能的作用机制研究

3.2.1. TPEN能够抑制Vpx诱导的SAMHD1的降解

3.2.2. TPEN抑制Vpx依赖的SIV病毒在巨噬细胞中感染能力

3.2.3. TPEN抑制Vpx与DCAF1之间结合

3.2.4.实验讨论

3.2.5.小结

3.3. 锌离子结合区对Vpr挟持CRL4（DCAF1）E3连接酶具有重要作用

3.3.1. HHCH高保守功能区对Vpr降解HLTF蛋白至关重要

3.3.2. HHCH高保守功能区影响了Vpr与DCAF1的结合

3.3.3. HHCH功能区位点突变不影响Vpr在细胞内的定位

3.3.4. HHCH高保守功能区不影响Vpr二聚体/低聚体的形成

3.3.5. 实验讨论

3.3.6. 小结

3.4. 锌离子螯合剂TPEN抑制Vpr功能的作用机制

3.4.1. TPEN抑制Vpr与DCAF1之间的结合

3.4.2. TPEN抑制Vpr诱导的HLTF的降解

3.4.3. TPEN抑制Vpr引起的细胞G2周期阻滞

3.4.5. 实验讨论

3.4.6. 小结

第四章 结论

参考文献

作者简介以及所取得的科研成果

致谢