疾病相关的肝转运蛋白以及与CYP3A4的人肝微粒体的荧光分子的研究

摘要

荧光是分子从激发单重态的最低振动能级回到基态的过程中发射出的光，具有很高的灵敏性，且极易被检测。因此，利用分子的荧光特性可以测定物质成分或者检测反应进程。然而，大多数的待测分子本身没有荧光特性，而且在化学反应的过程中，也很少能够发出荧光，这一问题大大限制了荧光检测技术的应用。因此，荧光探针成为研究的热点。小分子荧光探针通过与待测物发生物理性相互作用或化学结构的变化实现荧光的变化，这使得荧光成为一种监测分子变化过程的工具。基于这一特性，荧光探针在探索生命活动的规律、医疗器械的开发、环境的检测等方面具有良好的应用前景。荧光分子被广泛应用的主要原因的是：荧光具有很高的敏感度，荧光显微镜可以进行瞬时立体的高分辨率细胞成像；另外大量的分子之中含有荧光团。因此荧光探针可以被那些没有深入参与研究该领域的人广泛使用。我们可以通过控制激发和发射波长、目标结合亲和力、化学反应性和亚细胞定位探针结构。荧光分析的一个重要特征是可以通过使用荧光板读取器来完成高通量分子筛选。也就是说，这门技术可以用于筛选应用、构造光纤和目视检测分析物快速的筛选大量化合物。目前，已有很多商业化分子和从植物中提取的分子，这些潜在的药物分子为通过荧光板读取器高通量筛选有效分子提供了资源。虽然荧光探针的重要性可能显而易见，但要设计和合成新的探针用于自己的研究仍然是一个挑战。 我们熟知的三种机制：光诱导电子转移（PET）；分子内电荷转移（ICT）和荧光能量共振转移（FRET）. 光诱导电子转移作为一种最先出现的一种荧光反应机制，在生物化学领域有着广泛的应用，我们致力于应用该机制去建立荧光和乳酸转运蛋白的一种联系。我们知道乳酸转运蛋白与肝部疾病（如脂肪肝）有密切联系，我们就希望能开发一种检测柠檬酸转运蛋白的荧光分析技术。脂肪肝有许多的并发症，比如肥胖、动脉粥样硬化和胰岛素耐受等。因此，脂肪肝是严重威胁人类健康的一大杀手。由于肝脏本身可以合成脂肪，因此简单的控制饮食不能治愈脂肪肝，而需从其发病机理出发进行研究。研究发现肝脏可以将多种物质转化为脂肪酸，进一步转化为脂肪。其中，乳酸是一种最主要的脂肪酸前体，而不依赖于ATP转运蛋白（“泵”）的作用下从血液进入肝脏中，且乳酸泵的动力是质子的释放。因此，乳酸泵的小分子抑制剂可用作治疗脂肪肝的药物。但是，目前还没有合成此类抑制剂的报道，这是由于尚无对泵蛋白活性进行分析的实验方法。而目前仅已知原核生物的乳酸泵晶体结构。通过合作课题组,我们可以获得了独一无二且稳定的样品：乳酸泵过量表达的人类肝细胞系。我们提出了一系列基于膦的荧光探针，用于开发重要的肝肾酶的药物发现试验。在试验的基础上采用膦电子的转移引起荧光的猝灭。如果检测的阳性信号涉及磷化氢氧化成氧化膦，则阻止了电子转移对荧光的猝灭。荧光发射的增加，将成为底物或药物转运的阳性信号。 我们将含有磷化氢衍生物结构的荧光探针分子应用于此类荧光分析技术。此类荧光探针的机理为：当磷化氢结构连接到一个荧光团时，由于磷上孤对电子的光诱导电子转移（PET）将导致荧光淬灭。但是，当磷化氢结构被氧化为膦氧化物时，不再发生光诱导电子转移，探针将具有荧光但由于没有可靠的基于底物结构的药物设计方法以及结构数据短缺，结果并不十分理想。但是以乳酸泵抑制剂为出发点，来筛选治疗脂肪肝药物的策略。我们和张宥偲老师课题组合作，他们能利用过量表达的乳酸转运蛋白培养稳定的人肝细胞，在这一基础之上的设计研究，为脂肪肝的生物学基础研究方面及寻找脂肪肝治疗潜在药物方面提供了新的思路。 在脂肪肝的治疗中，还没有以它们作为靶向目标研发相关药物的报道。为了识别乳酸泵的抑制剂，我们需要建立一种检测其活性的方法。荧光检测在此类活性检测中有着极大的优势：不仅灵敏度高，还可以与分子的高通量筛选兼容。这使得荧光检测法不仅能识别极弱的抑制剂，还能实现药物的快速筛选。我们的设计思路是用具有活性的乳酸类似物代替乳酸进行实验。这些类似物可以通过转运蛋白进入细胞，并且在细胞内与具有磷化氢结构的荧光探针发生反应并产生荧光信号。 叠氮化物可以在细胞内选择性的与磷化氢反应得到膦亚胺和N2，膦亚胺可以进一步迅速水解为胺和膦氧化物。所以在乳酸类似物的选择上，首选化合物为3-叠氮乳酸。 叠氮乳酸的制备路线如下：以环氧丙醇为起始原料，依次通过杰克布森动力学拆分（Jacobsen’s Kinetic Resolution），克劳斯氧化（Kraus Oxidation），最后与叠氮钠发生亲核开环反应制备。 之前的研究表明，萘酰亚胺类可以进入细胞并进行相关的细胞实验。虽然它的荧光分子的荧光强度均不及荧光素衍生物，但是它们具有易制备、光稳定性强等优点，且已有文献报道合成它的氨基荧光基团。 科研工作者们尝试合成膦类分子用于检测细胞内过氧化氢或叠氮化物，但是还没有找到荧光效果较好的膦类荧光探针，这主要是因为此类分子极易进行光氧化反应。 对于磷化氢探针我们有两个研究方向。为了避免光氧化反应，选择不发生光氧化反应的三苯基膦衍生物，2-二苯基膦苯甲酸和4-二苯基膦苯甲酸。2-二苯基膦苯甲酸和4-二苯基膦苯甲酸都是已知化合物，但是按照文献的方法，我们并没有成功合成出这两个分子。 在生物化学中，通常用三(2-羧乙基)膦（TCEP）来降低细胞渗透性。TCEP分子中有三个羧酸基团，所以它不易与其他分子偶联。我们课题组计划先合成三乙酯，然后用过量的酯和胺结合，然后水解形成游离的二元羧酸盐。如果二元羧酸盐没有细胞渗透性，可以选择在细胞上负载乙酯。乙酯进入细胞后，会被酯酶水解成游离的羧酸。但是在合成过程中发现，和TCEP反应，生成的不仅仅是单酯，有二聚物，甚至是多聚物，且难以分离。 但是经过我们的实验表明，我们的设想并没有完全成立，膦没有与氨乙基基团与荧光基团较好的结合。由于电负性，中性膦比中性胺具有更好的亲核性，中性氨基乙基膦的氨乙基很难和荧光基团结合。其次，我们发现，即使我们可以连接到荧光基团的膦，也会立即被光氧化膦氧化物。今年早些时候，我们实验过程中的“光氧化问题”得到了理论支持。因此我们在进一步探索新的荧光分子，我们知道胺的亲核性较弱，因此它的pKa较小，在和荧光团相连接之后，胺基和酰胺基的供电子能力不同，所以他们的光谱性质也就不同。但是肼分子会比胺有更好的亲核性，所以它能更快的酰基化，且它的乙酰化产物和之前分子的光谱性质无大的改变，且它的酰基化更快。因此我们希望进一步把目标转向合成与肼相结合的荧光分子，这一部分研究仍在进行中。 在我们合成探针之后，为了筛选出此类抑制剂，我们可以使用商业化的化合物样品集合。这些化合物可通过96孔荧光板读取器进行高通量筛选。这项分析工作可与我校的张宥偲老师课题组合作完成。张老师课题组研发了含有过表达乳酸转运蛋白的稳定人类肝细胞的细胞培养方法。该实验方法将利用叠氮乳酸在已知生物实验方法的基础上建立。在进行转运实验时，需首先细胞将放在有荧光探针的转运缓冲液中培养。转运缓冲液中包含有叠氮乳酸，并且用乳酸转运缓冲液作为对照组。 为了进一步探索荧光分子的应用，我们着手研究荧光分子在代谢中起的检测作用。我们筛选合适的已经合成的荧光分子与细胞色素P450(cytochromeP450或简称CYP450)中与人体中CYP3A4对其的作用。细胞色素P450是一类亚铁血红素细胞中，有2000多个亚型，像CYP1A1和CYP3A4。CYP450主要分布在内质网和线粒体内膜上，在人体中，CYPs大部分存在肝脏中。细胞色素P450作为一种末端加氧酶，它参与内源性物质和包括药物、环境化合物在内的外源性物质的代谢且参与生物体内的甾醇类激素合成等过程，而且对细胞因子和体温调节都有重要影响。亚铁血红素是硫醇盐蛋白的超家族，它们负责亲脂性（油脂类）有机分子的“第一阶段”代谢。第一阶段的代谢涉及有机分子的氧化，因此会形成更多的极性产物。在三价铁---Fe（Ⅲ）包含在在血红素辅基的酶中，Fe（Ⅲ）结合在酶的活性位点---半胱氨酸的巯基链区域。活性位点的大小和形状的变化以及Fe（Ⅲ）血红素的取向决定了CYP的选择性（或非选择性）。然后我们基于已经合成的分子，希望能从中筛选出细胞色素P450（CYP）活性荧光探针。通过开始筛选我们的荧光分子，我们发现了一类新的CYP3A4荧光探针-NBD探针。在我们测试的两个这类化合物中，在人体内的CYP3A4代谢之后，发射波长发生很大变化。 我们接下来要做的是化合物在CYP代谢之后结构的确定和光学表征。我们将快速合成大量的的苯并恶唑衍生物，然后可以对CYP3A4和其他CYP酶进行筛选。

目录

声明

Chapter 1 Introduction

1.1Fluorescent probes

1.2 Classification of fluorescence

1.2.1 Photoinduced Electron Transfer (PET)

1.2.2Intramolecular Charge Transfer (ICT)

1.2.3F(o)rster Resonance Energy Transfer (FRET)

1.2.4 Reduction oxidation reaction (Redox)

1.3Overview of some common fluorophores used in fluorescent probes

Chapter 2 Fluorescence-based assays fordisease-related liver transport protein

2.1Preparation of phosphine-fluorophore substrate

2.2Synthesis of naphthalimide derivatives

2.2.1Reactions involving 4-(diphenylphosphino)benzoic acid

2.2.2Reactions involving 2-(diphenylphosphino)benzoic acid

2.2.3 Reactions involving tris-carboxyethylphosphine (TCEP)

2.3Synthesis of lactic acid analogue

2.4 Conclusion

Chapter 3 Develop stable human liver celland luminescene assay on CYP3A4

3.1Developed stable human liver cell cultures with over-expressed lactate transporters

3.2Luminescene assay on CYP3A4 of human liver microsome

3.3Fluorescent molecules for biochemistry assay

3.4 Conclusion

Chapter 4 Experimental Section

4.1 General

4.2 Synthesis procedures

4.2.1Synthesis of naphthalimide derivatives

4.2.2 Synthesis of triphenyl phosphine

4.2.3Coupling with analogs of triphenyl phosphine

4.2.4 Reactions involving 4-(diphenylphosphino)benzoic acid

4.2.5 Reactions involving 2-(diphenylphosphino)benzoic acid

4.2.6 Reactions involving 5-nitro-1,2-dihydroacenaphthylene

4.2.7Reactions involving hydrazine hydrate

4.2.8Reactions involving TCEP

4.2.9Synthesis of lactic acid analogue

4.2.10Synthesis of Jacobsen catalyst

4.2.11Synthesis of molecules inbiochemistry assay

参考文献

Appendices

Appendix A:NMR data

Appendix B:Fluorometric analysis

Appendix C:HPLC data analysis

Appendix D:GC data analysis

Appendix E:Data of luminescene assay in CYP3A4 of human liver

致谢