肝炎病毒（HBV、HCV）基因诊断芯片的研制和新型肝炎病毒SENV的实验研究

摘要

HBV和HCV是临床上最常见、危害最大的两种肝炎病毒,其长期持续的慢性感染与肝硬化、肝癌的发生发展密切相关.随着人们对肝炎病毒认识的不断深入,尤其是肝炎病毒基因组学研究的进展,使临床上现有的血清免疫学方法和以单一PCR技术为主的检测方法其局限性越来越明显,由于不能真实、全面地反映患者体内病毒基因组的各种变异和动态变化,对患者个体的针对性诊断和治疗也受到很大限制.为及时将肝炎病毒的基因研究成果应用于临床实践,需要利用新的分子生物医学技术,研究和开发肝炎病毒的新型诊断方法和诊断试剂.据此,我们重点研究了HBV和HCV基因诊断芯片的制备、应用,以及新型肝炎病毒SENV的实验研究.该文涉及的实验方法包括生物信息学分析(即芯片上探针和PCR引物的设计、测序序列的检索和比对)、探针和PCR引物的合成、PCR产物直接测序、基因芯片上探针的点样制备方法、血清中病毒的提取方法、PCR扩增和地高辛标记、分子杂交及显色、芯片杂交结果的数据处理等.芯片制备过程中的优化环节包括:尼龙膜型号和探针固定照射剂量的选择,探针3'末端加尾碱基数的确定,利用探针的互补寡核苷酸序列和部分PCR产物的测序验证芯片杂交的特异性,利用PCR扩增直接参入地高辛信号分子,分析其长度、浓度及杂交时间对杂交信号的影响,比较了HBV标本的不同处理方法和不同PCR引物组合的扩增效率.经过二年多的反复实验研究,初步完成HBV基因芯片、HCV基因芯片和HBV、HCV联检芯片的制备.经过近三年的实验研究取得以下成果:①建立了具有独立自主知识产权的从微点阵制备到PCR标记、芯片杂交检测和软件分析的基因芯片操作平台.②自行设计了HBV基因分型和基因变异诊断芯片、HCV基因分型芯片和HBV、HCV联检芯片.初步临床应用结果表明,该芯片具有较好的准确性和特异性,与测序结果相比较,HBV芯片准确性达95.8﹪,HCV芯片准确性达98.3﹪.③实验研究表明,SENV可能与肝病不相关或条件致病,并且该病毒家族的基因型分类有待进一步的探讨.

目录

前言—国内外研究进展综述

一、生物芯片

二、肝炎病毒基因诊断的研究进展

三、肝炎病毒诊断芯片的研究状况

四、SENV的研究进展

材料和方法

一、实验材料

二、实验方法

实验结果

一.基因芯片实验体系的优化

二、HBV基因芯片的制备和应用

三、HCV基因分型芯片的研制及应用

四、HBV、HCV联检基因芯片

五、SENV的致病性研究

讨论

一、肝炎病毒基因芯片制备的方法学

二、肝炎病毒基因芯片的临床应用

三、SENV的临床检测实验研究

结论

参考文献

附录（材料和方法的图表）

致谢

个人简历