pND6-1质粒中重复萘降解基因的鉴定和生态意义

摘要

许多细菌具有降解环境中生物异源物质的能力，其降解基因常位于质粒上。萘是常见的环境污染物，在工业废水中的检出率高达10％。ND6是本实验室分离的高效降解萘的菌株，它可以在无机盐液体培养基中于48h内将2g/L的萘降解98％。该菌株含有两个大质粒，其中与萘降解有关的是101858bp的质粒pND6-1，另一个122055bp的质粒pND6-2功能不明。pND6-1中9个萘降解基因(nahAaAbAcAdBFCED)构成上游操纵子，它们编码的酶催化萘降解成水杨酸，另外11个萘降解基因(nahGTHINLOMKJY)构成下游操纵子，负责将水杨酸降解成儿茶酚，并通过间位裂解途径将儿茶酚进一步降解成可以进入三羧酸循环的小分子物质。 尼龙寡聚体质粒pOAD2、2,4-D质粒pJP4及萘降解菌PseudomonasstutziriAN10的染色体上都存在重复降解基因。重复降解基因的存在并非偶然事件，它是细菌为了适应环境长期进化的结果。生物信息学分析表明，萘降解质粒pND6-1中除了“经典”的水杨醛脱氢酶基因nahF和水杨酸羟化酶基因nahG外，还存在它们的重复基因nahV和nahU，这两个重复基因分别位于萘降解的上游操纵子和下游操纵子之外。 本论文的主要研究内容是：通过16SrRNA基因序列分析和Biolog代谢指数测定确定ND6菌株的分类地位；通过滤膜杂交实验确定pND6-1质粒能否进行接合转移；克隆和表达两个重复的萘降解基因nahV和nahU并对它们编码的酶进行纯化和鉴定；通过DNA杂交实验证明nahU基因存在的普遍性并对其生态意义进行探讨。 对ND6菌株的16SrRNA基因序列所进行的PCR扩增、克隆、测序和Blast分析表明，它与假单胞菌属的多株细菌具有99％的同源性。Biolog代谢指数测定结果显示ND6菌株与恶臭假单胞菌的匹配程度为0.65。综合上述两项实验结果，ND6菌株被鉴定为恶臭假单胞菌(Pseudomonaseputida)。 滤膜杂交实验表明，ND6菌株的pND6-1质粒可以通过接合作用转移到大肠杆菌AD256菌株中。由于ND6菌株不含有接合转移基因，所以推测pND6-2质粒中的8个接合基因与pND6-1质粒的转移有关。这是第一个报道，一个质粒的接合基因可以促进另外一个降解质粒的转移。 以pND6-1为模板，设计引物分别对重复的水杨醛脱氢酶基因nahV和重复的水杨酸羟化酶基因nahU进行PCR扩增，然后分别在高表达载体pET-21b(+)中定向克隆，并在E.coliBL21(DE3)细胞中于20℃低温表达。将C-端带有HisTag的重组蛋白通过Ni-NTA亲和层析加以纯化，然后对两种新酶NahV和NahU的酶学性质进行详细研究，并与它们对应的同工酶NahF和NahG的性质进行比较。 NahV具有广泛的底物范围，它能以水杨醛、5-氯水杨醛、间硝基苯甲醛、辛醛、甲醛、邻硝基苯甲醛、邻甲氧基苯甲醛、戊二醛和乙二醛为底物进行催化反应，而且NahV和NahF对不同底物的催化效率不同。NahV对底物水杨醛和辅酶NAD+的米氏常数Km值及最大反应速度Vmax都小于NahF，这表明NahV对底物浓度更加敏感，相对更低的底物浓度就可以促进酶促反应的发生，但是在相同底物浓度的情况下NahF催化的反应速度要比NahV快。Fe2+对NahV和NahF都有显著的激活作用，而Cu2+、Zn2+只对NahV有激活作用。生物信息学分析发现，水杨醛脱氢酶重复基因nahV与其它菌株的水杨醛脱氢酶的氨基酸序列同源性仅为56％，是完全不同的新基因。所有醛脱氢酶都具有保守的氨基酸序列LELGGKSP，但是在NahV的保守氨基酸序列中，丝氨酸(S)被丙氨酸(A)所替换。GPC凝胶色谱分析结果表明，NahV蛋白可能由两个相同的亚基构成。 NahU也具有广泛的底物范围，能以水杨酸、乙酰水杨酸、磺基水杨酸、甲基水杨酸、氯代水杨酸和3,5-二硝基水杨酸为底物进行催化反应。NahU对底物水杨酸和辅酶NADH的Km值和Vmax值都要大于NahG。核酸序列比较表明，水杨酸羟化酶重复基因nahU是与nahG和另一个重复基因nahW都不相同的新基因。NahU和NahG都属于单加氧酶家族，它们都拥有辅酶FAD的结合位点GxGxxG。 以质粒pND6-1上“经典”的水杨酸羟化酶基因nahG和重复的水杨酸羟化酶基因nahU为探针，分别与分离自纪庄子污水处理厂的活性污泥和大港油田及天津香料厂混合废水的萘降解菌的总DNA杂交，结果表明，在被检测的14个菌株中都存在nahG基因，而nahU基因只存在于来自混合工业废水的菌株中。这表明，类nahU基因广泛存在于自然界的萘降解细菌中，但不是必需的，是否存在这类基因可能与细菌的生长环境有关。

目录

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第一章绪论

1.1降解性可动遗传因子

1.1.1降解质粒

1.1.2降解性转座子

1.1.3降解性可动遗传因子的应用

1.2萘生物降解

1.2.1萘降解途径

1.2.2萘降解质粒NAH7

1.2.3萘降解质粒pND6-1

1.2.4萘降解质粒pDTG1

1.3降解基因的重复及其生态意义

1.3.1尼龙寡聚体质粒pOAD2中nylB基因的重复

1.3.2 2,4-D质粒pJP4中tfd基因丛的重复

1.3.3 Pseudomonas stutziriAN10菌株中nahG基因的重复

1.3.4重复降解基因的生态意义

1.4研究目的和主要内容

1.4.1研究目的

1.4.2主要研究内容

参考文献

第二章萘降解菌ND6菌株的分类鉴定

2.1前言

2.2 16S rRNA基因序列分析

2.2.1原理

2.2.2材料

2.2.3方法

2.2.4结果与讨论

2.3 Biolog代谢指数测定

2.3.1原理

2.3.2材料

2.3.3方法

2.3.4结果与讨论

2.4本章小结

参考文献

第三章萘降解质粒pND6-1的接合转移

3.1前言

3.2材料

3.3方法

3.4结果与讨论

3.4.1 ND6和AD256菌株抗生素抗性的确定

3.4.2 pND6-1的接合转移

3.4.3接合子筛选

3.4.4接合子鉴定

3.4.5 pND6-1接合转移机制的探讨

3.5本章小结

参考文献

第四章重复水杨醛脱氢酶基因nah V的克隆、表达和酶鉴定

4.1前言

4.2材料和方法

4.3结果与讨论

4.3.1 nahV和nahF高表达载体的构建

4.3.2水杨醛脱氢酶活力测定方法的建立

4.3.3 NahV和NahF粗酶液保存条件的优化

4.3.4表达菌株产酶条件的优化

4.3.5 NahV和NahF的纯化

4.3.6 NahV和NahF的酶学性质

4.3.7 NahV和NahF的生物信息学分析

4.3.8 NahV的凝胶色谱(GPC)分析

4.4本章小结

参考文献

第五章重复水杨酸羟化酶基因nahU的克隆、表达和酶鉴定

5.1前言

5.2材料

5.3方法

5.4结果与讨论

5.4.1 nahU和nahG高表达载体的构建

5.4.2 NahU和NahG粗酶液保存条件的优化

5.4.3表达菌株产酶条件的优化

5.4.4 NahU和NahG的纯化

5.4.5 NahU和NahG的酶学性质

5.4.6 nahU和nahG的生物信息学分析

5.5本章小结

参考文献

第六章重复水杨酸羟化酶基因存在的普遍性和生态意义

6.1前言

6.2材料和方法

6.2.1培养基

6.2.2菌株分离

6.2.3 DNA点杂交

6.3结果与讨论

6.3.1萘降解菌株的分离

6.3.2 nahG和nahU与萘降解菌株总DNA的杂交

6.4本章小结

参考文献

第七章结论、创新点和建议

7.1结论

7.2创新点

7.3对今后研究工作的建议

致谢

作者简历

在学期间发表的论文

Overexpression,purification and characterization of a new salicylate hydroxylase from naphthalene-degrading Pseudomonas sp.strain ND6

假单胞菌ND6菌株水杨酸羟化酶基因（nahG）的核苷酸序列分析和酶鉴定