蝴蝶兰细菌性软腐病菌分子检测技术的研究

摘要

蝴蝶兰细菌性软腐病是蝴蝶兰的头号杀手。Erwiniachrysanthemi(菊欧文氏菌)、Erwiniacarotovorasubsp.carotovora(胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种)是引起蝴蝶兰软腐病的主要病原细菌。据调查，在我国造成蝴蝶兰软腐病的细菌都是Erwiniachrysanthemi，被列入我国三类检疫性有害生物。 本论文主要进行了菊欧文氏菌检测技术的研究。 选用16S-23SrDNA间的ITS(IntergenicTranscribedSpacerRegion)序列的通用引物A(5’-GAAGTCGTAACAAGG-3’)和B(5’-CAAGGCATCCACCGT-3’)，对菊欧文氏菌3个菌株进行了ITS扩增，所有菌株均得到了一条分子量约为240bp的扩增产物。对参试的3个菊欧文氏菌菌株的扩增片段进行片段回收、克隆和测序，将这些序列与数据库中已报道的其它ITS序列进行同源性比较，在此基础上设计并合成菊欧文氏菌特异性引物L1(5’-CCGGATTGTTAAAGAGCAGA-3’)和L2(5’-GACGCCAATGACTGACAGTG-3’)。并用这对特异性引物分别对14个参试菌株进行PCR扩增，证明这对特异性引物具有很高的特异性。 利用免疫吸附技术，研制了免疫吸附-PCR技术。选用菊欧文氏菌的001菌株，由戊二醛固定全菌体抗原，制备的抗血清效价和特异性都比较高，可以用于ELISA实验。应用免疫吸附-PCR技术，使检测纯菌的灵敏度比标准PCR技术提高10倍，检测样品中菊欧文氏菌灵敏度提高了100倍。该方法简单易行，准确灵敏，具有广泛的应用前景。 实时荧光定量PCR技术是一种新近发展起来的检测技术。本研究采用SYBRGREENI染料法，用多个引物分别对菊欧文氏菌进行扩增，从而进一步验证了特异性引物L1-L2具有很高的特异性；用此法检测样品中菊欧文氏菌的灵敏度可达到102cfu/ml，比标准PCR技术提高了1000倍。SYBRGREENI染料法不需要设计合成序列特异性的探针，是一种简便、成本低廉、检测灵敏度很高的实时监测方法。

目录

文摘

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第一章引言

第二章材料和方法

第三章结果与分析

第四章讨论

结论

参考文献

致谢

附录

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