新Vip3Aa的克隆表达及功能分析

摘要

营养期杀虫蛋白(VegetativeInsecticidalProteins，VIPs)是苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis，Bt)在营养期分泌的一种新型杀虫蛋白，具有对鳞翅目昆虫广谱的杀虫活性，且与Bt杀虫晶体蛋白(Insecticidalcrystalproteins，ICPs)作用机理完全不同。因而，分离克隆新型高毒力的营养期杀虫蛋白基因对于构建高效广谱的基因工程微生物和培育转基因抗虫植物、控制害虫抗性发展都具有重要的意义。 本文利用PCR方法检测了本室保藏的30株苏云金芽孢杆菌。发现其中vip3Aa基因菌株阳性率达到63％，远远高于以往文献报道值(约15％)。Bt9816C菌株是vip3Aa基因阳性菌株之一，其发酵上清液对棉铃虫和甜菜夜蛾的幼虫均有很高的毒力。本文即对该菌株中的vip3Aa基因进行深入研究。 我们根据GeneBank中的收录的vip3Aa基因序列(AccessionNo.AF499736)设计了PCR引物，将Bt9816C中的vip3Aa基因扩增、克隆至pUC18-T载体上并进行了测序。利用BLAST对测序结果进行同源性分析，结果显示该序列与GeneBank中已报道的vip3Aa序列相似度达到99％。该vip3Aa基因已经提交至GeneBank(登陆号：AY945939)并被苏云金芽孢杆菌δ-内毒素命名委员会(Bacillusthuringiensisdelta-endotoxinnomenclaturecommittee)命名为vip3Aa18基因。随后，我们使用一些软件对vip3Aa18基因的氨基酸序列结构进行了分析。利用SMART程序分析的结果表明，在Vip3Aa18的C端存在一个糖结合域(CBM49)；利用SignalP3.0及SecretomeP2.0程序分析的结果表明，Vip3Aa18的N端存在与其它芽孢杆菌的信号肽相类似的序列并且是以非典型分泌方式(non-classicalproteinsecretion)分泌到胞外的；利用Tmap、TMpred以及Toppred软件分析发现在Vip3Aa18大约270-300位氨基酸残基处有一个跨膜区；用DISULFIND分析发现Vip3Aa18的292位氨基酸残基和401位氨基酸残基之间有二硫键形成。 接着，我们将vip3Aa18基因全长片段插入表达载体pET28(a+)中，并在大肠杆菌BL21菌株中进行表达、纯化。生物测定的结果表明，Vip3Aa18蛋白对棉铃虫及甜菜夜蛾幼虫均有毒力，但对秀丽小杆线虫没有活性。最后，我们将Vip3Aa18蛋白与提取自BtHD-73菌株的Cry1Ac晶体蛋白混合，作用于棉铃虫幼虫，结果表明二者之间存在协同作用。

目录

文摘

英文文摘

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第一章引言

第二章材料与方法

第三章实验结果与分析

第四章讨论

结论

致谢

参考文献

附录