哺乳动物内质网体和细胞核中亲免蛋白的研究

摘要

本文分为两个部分：第一部分是对哺乳动物内质网体中FKBP23与BiP 特异性结合及活性方面的研究；第二部分是对哺乳动物细胞核中hCyP33与mRNA特异性结合及活性方面的研究。 第一部分研究的FKBP23属于亲免蛋白家族成员。亲免蛋白具有两大主要特征：一是遗传上的保守性，二是肽脯氨酰顺反异构酶(PPIase)活性。另一个蛋白质BiP则是Hsp70家族在内质网体中的成员，在生命体中，蛋白质在其生理位置需折叠成具有正常生理功能的空间结构才具有活性。Hsp70家族蛋白在生物体内的主要功能是蛋白质在细胞内亚细胞结构间的转运过程及其折叠过程中，充当分子伴侣的角色，使蛋白质在其生理位置上能够折叠成具有正常生理功能的空间结构并具有活性。 在此部分中我们通过免疫沉淀的方法证明了在小鼠内质网体中 mFKBP23与mBiP特异性地结合并且这种结合也是受Ca<'2+>浓度的调控，结合与解离的突变点也在2～3 mM 之间，与先前体外结论一致。为了更加具体地确定FKBP23与BiP的结合位点，我们分段克隆了这两种蛋白的N端和C端蛋白，并通过亲和吸附的方法证明了mFKBP23的C端与mBiP的C端相结合，mFKBP23<,N> 与mBiP<,N>之间的微弱结合是酶(PPIase)与BiP<,N>上的底物之间的结合。此外，我们还采用了丙酮酸激酶-乳酸脱氢酶偶联酶法证明了只有结合的mFKBP23，而不是游离的mFKBP23，抑制了mBiP的ATPase活性。我们也可以推断出mFKBP23对mBiP的ATPase活性的抑制是由于mFKBP23的N端的PPIase区域。 本文的第二部分研究的是一种在人T细胞核内发现的亲环素类蛋白，亲环素类蛋白是一类普遍存在于原核、真核生物和多种亚细胞结构中的蛋白，因具有肽脯氨酰顺反异构酶活性，在新生肽链的折叠、输送和生物大分子的组装过程中起关键作用。从结构上看，hCyP33包含两个功能区域：一个N端的RNA结合区域，一个C端的肽脯氨酰顺反异构酶区域。 在此部分中我们采用离子交换层析法证实了hCyP33与poly(A)<'+>RNA 具有特异性结合的特征，而同poly(A)<'->RNA和tRNA都不结合。此外，我们还采用了一个标准肽实验测定PPIase活性的方法证实了hCyP33有PPIase活性并且hCyP33与mRNA的特异性结合能够促进hCyP33的PPIase活性。并且这种促进能够被CsA所抑制。由此说明，人亲环素33是一种poly(A)<'+>RNA即mRNA结合蛋白，并作为功能蛋白有可能参与T细胞核内RNA的输送过程或与转录有关的信息传递过程。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

第一部分哺乳动物内质网体中FKBP23与BiP特异性结合及活性方面的研究

第一章引言

第一节亲免蛋白研究概况

第二节蛋白质折叠与分子伴侣

第三节本课题提出的指导思想

第二章实验部分

第一节试剂及仪器

第二节缓冲液及贮存液

第三节实验方法

第三章实验结果与讨论

第一节实验所需目的蛋白的制备

第二节mFKBP23序列结构特征分析

第三节哺乳动物中FKBP23与BiP的同源性分析

第四节小鼠肝脏ER中mBiP与mFKBP23的检测

第五节体内(in vivo)结合研究

第六节片断结合实验结果

第七节ATPase活性的测定

第八节实验进一步研究的方向

第四章第一部分总结

参考文献

第二部分哺乳动物细胞核中hCyP33与mRNA特异性结合及活性方面的研究

第五章引言

第一节RNA结合蛋白

第二节人亲环素33及课题提出的意义

第六章实验部分

第一节试剂及仪器

第二节缓冲液及贮存液

第三节实验方法

第七章实验结果与讨论

第一节实验所需目的蛋白的制备

第二节人Jurkat T细胞核中hCyP33的检测

第三节人亲环素33序列结构特征分析

第四节hCyP33与RNA结合研究

第五节PPIase活性的测定

第六节实验进一步研究的方向

第八章第二部分总结

参考文献

致谢

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果